如何阅读质粒图谱

《如何阅读质粒图谱》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、如何阅读质粒图谱－也谈谈您的经验！？载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一、          一个合格质粒的组成要素复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。Ø        抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+，Kan+Ø        多l克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段Ø         P/E启动子/增强子Ø         Terms终止信号Ø        加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用二、           如何阅读质粒图谱

2、第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记：（1）Ampr水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr可以阻止四环素进入细胞。（3）camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活。（5）hygr使潮霉素β失活。第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNA插入片

3、段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。相关概念：启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。 增强子/沉默子－为真核l基因组（包括真核

4、病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子－负增强子，负调控序列。核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。SD序列（Shine-Dalgarnosequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD序列：在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。在原核生物中,核糖体中与mRNA结合位点位

5、于16SrRNA的3＇端,mRNA中与核糖体16SrRNA结合的序列称为SD序列(SDsequence),它是1974年由J.Shine和L.Dalgarno发现的,故此而命名。SD序列是mRNA中5＇端富含嘌呤的短核苷酸序列,一般位于mRNA的起始密码AUG的上游5～10个碱基处,并且同16SrRNA3＇端的序列互补。 l转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。三、          载体及其分类：载体：即要把一个有用的基因（目的基因—

6、—研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。载体的分类―――按功能分成：（1）克隆载体都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨行载体）（2）表达载体具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。―――按进入受体细胞类型分

7、：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttlevector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.P.S.穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。基因工程载体的3个特点：（一）都能独立自主的复制：载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。（二）都能便利的加以检测：如载体的药物抗性基因，多是抗