分子标记技术在农业中的应用

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1、湖南农业大学课程论文学院：班级：姓名：学号：课程论文题目：分子标记技术在农业中的应用课程名称：分子生物学评阅成绩：评阅意见：成绩评定教师签名：日期：年月日分子标记技术在农业中的应用学生：刘结卯（动科院09级畜牧班学号：200940511227）摘要：自20世纪80年代以来，随着分子生物学技术在各个领域的发展，产生了另一类重要的遗传标记，即以直接检测DNA分子碱基序列变异=为基础的分子标记。植物在长期进化过程中产生的可遗传变异都是由于DNA序列变异而照成的，其变已有单碱基和多碱基突变（包括DNA重排、碱基替换、插入、缺失、异位、

2、倒位等）和重复序列引起的变异。关键词：基因、分子标记DNA、遗传、变异、应用、鉴定、定位一、什么是分子标记技分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记是DNA水平遗传多态性的直接的反映DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便 利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标

3、记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。理想的分子标记必须达以下几个要求：具有高的多态性；共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；能明确辨别等位基因；遍布整个基因组；除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；选择中性(即无基因多效性；检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；开发成本和使用成本尽量低廉；在

4、实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换) 但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。一、分子标记技术的分类（一）、基于分子杂交技术的分子标记技术此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA分子，然后用经标记的特异DNA探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。　（二）基于PCR技术的分子标记技术（1）随机引物的PCR标记所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的DNA区域事先未知。随机引物PCR扩增的DNA区段产生多态性的分子基础是模板DNA扩增区段上引物结合位点的碱基

5、序列的突变，不同来源的基因组在该区段上表现为扩增产物有无差异或扩增片段大小的差异。随机引物PCR标记表现为显性或共显性。（2）、特异引物的PCR标记　特异引物的PCR标记所用引物是针对已知序列的DNA区段而设计的，具有特定核苷酸序列（通常为18—24bp），可在常规PCR复性温度下进行扩增，对基因组DNA的特定区域进行多态性分析。（三）基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记　（1）扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP)　AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和

6、Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。AFLP是RFLP与PCR相结合的产物，其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组DNA产生不同大小的DNA片段，再使双链人工接头的酶切片段相边接，作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1—3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。引物由三部分组成：与人工接头互心碱基序列、限制性内切酶识别序列、引物3 ’端的选择碱基序列（1—1

7、0bp）。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。该技术的独特之处在于所用的专用引物可在知道DNA信息的前提下就可对酶切片段进行PCR扩增。为使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一 个酶为多切点，另一个酶切点数较少，因而AFLP分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。AFLP结合了RFLP和RAPD两种技术的优点，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。但它的技术费用昂贵，对DNA的纯度和内切酶的质量要求很高。尽管AFLP技术诞生时间较短，但可称之为分子标记技术的又一次重大突破，被认为是目前一种十分理想、

8、有效的分子标记。　（2）　酶切扩增多态性序列(CleavedAmplifiedPolymorphismSequences，CAPS)CAPS技术又称为PCR—RFLP，它实质上是PCR技术与RFLP技术结合的一种方法。CAPS的基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套