羟基红花黄色素a对缺氧心肌细胞的保护作用

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1、【摘要】目的　观察羟基红花黄色素A(HSYA)对缺氧心肌细胞的保护作用。方法　体外培养大鼠乳鼠心肌细胞，随机分为正常对照、缺氧损伤、HSYA1×10-6mol/L～1×10-10mol/L组、地尔硫艹卓组，同时设1×10-6mol/LHSYA正常对照组。以高纯氮气封罐,无糖无血清培养液密闭培养制备心肌细胞缺氧模型，观察各组细胞形态学变化，计数细胞搏动频率，测定心肌细胞存活率、细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞内的丙二醛(MDA)浓度及ATP酶活性。结果　与缺氧损伤组比较，1×10-7mol/L和1×10-8mol/L浓度HSYA组心肌细胞仍存在规律性搏动，细胞存活率

2、显著升高，细胞培养液中LDH活性、心肌细胞内MDA的含量明显低于缺氧损伤组(P＜005，P＜001)，而细胞内ATP酶的活性较缺氧损伤组显著增高(P＜001)。结论　1×10-7、1×10-8mol/L浓度的HSYA可有效的保护心肌细胞免受缺氧损伤。【关键词】羟基红花黄色素A；缺氧；心肌细胞　　羟基红花黄色素A(hydroxysaffloryellowA，HSYA)是从传统中药红花中提取的单体化合物。红花活血祛瘀消肿，通畅血脉，消肿止痛，临床上多用于冠心病，肺心病，脑血栓等疾病的治疗〔1〕。红花黄色素(SY)是从红花中提取的水溶性有效成分，具有扩张血管、改善心肌供血、

3、抑制血小板聚集、抑制血栓形成、抗氧化等多种药理作用〔2～5〕。近年来发现在SY中HSYA含量较高，是发挥上述药理作用的有效单体成分，已有许多实验证实HSYA具有抗脑缺血和神经保护作用〔6，7〕。但关于HSYA对心脏的作用研究甚少。本实验观察了HSYA对心肌的保护作用。　　1　材料与方法　　11　动物、药品与试剂　　新生Wistar大鼠(山东大学实验动物中心提供)，HSYA(山东省天然药物工程技术研究中心提供，纯度：98%，分子式：C27H32O16，易溶于水，pH≈5)，盐酸地尔硫艹卓(上海医药进出口公司，易溶于水)，胰蛋白酶(美国Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生

4、物工程材料有限公司)，DMEM干粉培养基(美国Sigma公司)，丝裂霉素(浙江海正药业股份有限公司)，乳酸脱氢酶、丙二醛和ATP酶测试盒(南京建成生物工程研究所)，四甲基偶氮唑盐即MTT(美国Sigma公司)。　　　　12　心肌细胞原代培养　　按照参考文献方法〔8，9〕并进行改进：取1～3日龄Wistar大鼠，无菌条件下剪取心脏，仔细剥离心房及大血管组织，然后于预冷的Dhank′s液中漂洗3次。将心肌组织放于50ml青霉素小瓶内，用眼科小弯剪将组织剪成约05mm碎块。加入约5倍体积的0125%胰蛋白酶溶液，置37℃恒温摇床(190r/min)消化5min，静置，待自

5、然沉降后弃去上清液。剩余沉淀再加入约5倍体积0125%胰蛋白酶，同样方法消化10min，静置后将上清液移入100ml输液瓶中，用2倍体积含20%新生牛血清的DMEM培养液终止消化。剩余沉淀用同样条件及方法继续消化4～6次。各次消化产物以1000r/min离心10min，弃去上清液后将细胞重悬于含20%小牛血清的DMEM培养液，然后接种于培养瓶中。在37℃、5%CO2培养箱中孵育50min后，轻轻吸出细胞悬液，接种至另一培养瓶继续培养50min，吸出细胞悬液以1×105/ml的密度接种于培养板，置37℃、5%CO2培养箱中培养。24h后更换培养液，并用05μg/ml的丝裂

6、霉素维持24h。以后每24h换液1次。　　13　细胞分组及缺氧模型建立　　131　细胞分组　　将培养72h的心肌细胞分为9组：(1)正常对照组：以含20%小牛血清的高糖DMEM培养基正常培养；(2)缺氧损伤组；(3)10-7mol/L盐酸地尔硫艹卓组；(4)～(8)为HSYA组，浓度分别为10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L；(9)10-6mol/LHSYA组(目的为观察本实验中最高浓度HSYA是否对正常细胞的生长产生影响)。　　132　缺氧损伤模型的建立及给药方法　　按照文献〔9〕操作，细胞分组后以正常培养基继续培养2h，然后以无糖HAN

7、KS液替换正常培养基，置于自制缺氧盒中通以高纯氮气(99%)40min后密闭培养3h，制备缺氧模型。各给药组先以含不同浓度HSYA或地尔硫艹卓的正常培养基培养2h,再更换为含药的无糖HANKS液，置于缺氧盒中同样培养3h。　　　14心肌细胞形态学及搏动频率观察　　经上述处理的细胞置于倒置显微镜的载物台上，于10倍镜下计数细胞搏动频率，40倍镜下观察心肌细胞形态学变化。　　15　MTT法测定细胞存活率　　将心肌细胞悬液接种到96孔板，每组5孔。分组及药物处理同前述。经处理后每孔加入2g/L四甲基偶氮唑盐(MTT)