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1、纤维素酶稳定性的研究一．背景介绍纤维素是地球上最丰富、最廉价的再生资源。有资料表明,全世界每年的植物体生成量达1500亿吨干物质,其中纤维素及半纤维素的总量为850亿吨。纤维素的基本单位是葡萄糖,但由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造,其外围又被木质素包围着,要把它水解成可利用的葡萄糖非常困难。所以到目前为止仍没有得到很好地利用。当前,新能源、新食品资源的开发利用是世界各国都在研究的重大课题,因此,纤维素酶的研究成为其主要组成部分。纤维素是一种多糖,是葡萄糖以β-1,4-糖苷键结合的聚合物,在自然界中储量
2、极其丰富,在纤维素酶的催化条件下可分解产生二糖或葡萄糖,纤维素的利用目前尚未完全开发,造成资源及能源的巨大浪费。为了更好地利用纤维素,愈来愈多的国内外学者开始关注纤维素酶的研究与应用,期望能借助纤维素酶将地球上最丰富(占全球总生物量80%)、最廉价的可再生资源纤维素转化为能直接利用的能源和资源。现在纤维素酶的应用已扩展到食品发酵、医药、纺织、日用化工、造纸、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域,其应用前景十分广阔。[1]1. 纤维素酶的组成纤维素酶是指3种起协同作用的一组酶的总称,现已确定
3、纤维素酶主要组分如下:内切型葡聚糖苷酶、外切型葡萄糖苷酶、纤维二糖酶。[2]2.纤维素酶的特性2.1内切型葡聚糖苷酶也称Cx酶、CMC酶。它以随机的形式在纤维素聚合物内部的非结晶区进行切割,对末端键的敏感性比间键小。其主要产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三糖等带非还原性末端的小分子纤维素。[2]2.2外切型葡萄糖苷酶又叫纤维二糖水解酶或微晶纤维素酶。该酶在天然纤维素的降解过程中起主导作用,它能从纤维素链的还原或非还原性末端切割糖苷键,生成可溶的纤维糊精和纤维二糖。[2]92.3 纤维二糖酶也称β2葡萄糖苷
4、酶,简称BG。它能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖。内切酶首先切割纤维素链使暴露出末端,然后外切酶连续切割纤维二糖单位,而β2葡萄糖苷酶通过水解纤维二糖或纤维糊精完成协同反应全过程。[2]3纤维素酶的作用机理研究人员对纤维素酶使纤维素转化为葡萄糖的过程提出了不同看法。1950年Reese对纤维素酶的作用方式提出了著名的C1-Cx假说,并得到大多数人的支持。C1-Cx理论要点是C1酶首先作用于结晶纤维素,使其改变成可被Cx酶作用的形式,Cx酶随机水解非结晶纤维素,即可溶性纤维衍生物和葡萄糖的β-1,
5、4-寡聚糖,β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水解成葡萄糖(如图所示)。上述的C1和Cx分阶段水解纤维素的理论在以后的实验中没得到证实。若先用C1酶作用结晶纤维素,然后将Cx酶与底物分开再加入Cx酶,如此顺序作用并不能将结晶纤维素水解,只有当C1、Cx以及β-葡萄糖苷酶同时存在才能水解天然纤维素。对于纤维素酶的作用机理,目前尚不十分明了,有待进一步研究。[1][2]4纤维素酶的热稳定性的研究4.1酶热失活中的动力学与热力学酶的动力学研究中一般只考虑初始反应速率及可逆反应，但在酶的应用及工艺设计时，酶的失
6、活速率就显得十分重要，特别是在连续流动的酶反应过程中，过程的经济可行性往往取决于酶的使用寿命。在失活动力学研究中，对于温度和失活速率常数之间的关系，可以用Arrhenius关系式：（1-2）许多酶的失活反应在一定温度范围内都服从Arrhenius关系。因此，在lnk～1/T图上可以获得频率因子k0和失活活化能Ea。但应该强调的是，对酶失活反应而言，9往往只在很小的温度范围内满足Arrhenius关系。基于酶的蛋白质本性，许多酶在45～50℃就会部分变性，在55℃时变性已经很严重了，会造成蛋白质球形结构的
7、破坏，使酶活性迅速下降。因此，在研究较宽范围内酶的失活动力学时，不能简单的依靠Arrhenius关系式。酶的热失活可能是可逆的、不可逆的或介于两者之间，根据平衡模型，在失活的初始阶段，存在一个简单的可逆过程，可以描述广泛温度范围内的酶失活动力学和活性的关系。在天然条件下，蛋白质折叠可以是自发进行的，根据热力学原理，蛋白质折叠是自由能减少过程，即折叠过程的自由能变化为负值。在高温和低温条件下，失活的自由能都可能为正值，此时去折叠过程是自发的。热力学参数是判断失活过程能否发生的基本物理参数。[1][2]热引
8、起酶失活首先使蛋白质分子构象改变而伸展，随时丧失生物活性。该变形过程可用下述方法测定，圆二色性、光旋度、差失扫描量热法、随加热测量pH的变化以及加热后测量剩余活力等。[3]4.2影响纤维素酶热稳定性的因素酶的化学本质是在氨基酸顺序排列成一级结构的基础上，通过氢键、盐键、疏水作用和静电作用等次级键再折叠成对活性发挥关键作用的二、三级结构(构象)的存在。因此，通过改变酶的内在氨基酸结构和外界化学微环境可影响酶的构象而提高其热稳定性。随着细胞工程
