实验三 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清脂蛋白

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1、实验三聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清脂蛋白课程名称：生物化学与分子生物学实验课年级：2005专业、层次：授课教师：符伟玉职称：讲师学时：3学时基本教材：自编《生物化学与分子生物学实验指导》教学目的与要求：1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，了解其操作方法。2、了解血清脂蛋白各组分的分离情况。大体内容与时间安排：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理5min2、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作步骤及示范10min3、聚丙烯酰胺凝胶电泳的注意事项5min4、学生做实验100min教学方法：讲授式+启发式教学重点、难点：重点：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理2、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操

2、作步骤难点：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理2、实验操作中的灌胶和点样4一、实验原理（一）浓缩效应在pH=6.7的浓缩胶中带电粒子的泳动速度为:Cl->protein>Gly，蛋白质样品夹在Cl-和Gly之间被挤压成一条狭窄的区带,使蛋白质样品浓缩。（二）电荷效应不同蛋白质pI不同，在相同pH值下所带电荷不同，因此在相同电场强度作用下，在电场中的移动（泳动）速度不同，可以根据这一效应把蛋白质分成不同的区带。（三）分子筛效应所聚合形成的PAG为多孔网状结构，对大分子物质的穿透有一定阻力，蛋白质在通过具有均一孔径的凝胶时，因颗粒大小不同，形状规则程度不同，所受阻

3、力也不相同。利用本效应也可以将蛋白质分离为不同的区带。颗粒大形状不规则的分子→阻力↑→电泳v↓颗粒小,球形分子→阻力↓→电泳v↑将血清脂蛋白用苏丹黑B丙二醇预染，加于聚丙烯酰胺凝胶柱上进行电泳。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳具有浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，因此它的分辨率高，可将血清脂蛋白各组分清晰分开。二、操作步骤1、4%凝胶制备：将清洁的0.5×1.5cm玻璃管若干支垂直插在橡皮座上，以备制胶。从冰箱中取出下列试剂，在室温中平衡，然后在一小三角瓶中依次加入：30%Acr1.3mlTris-EDTA-Na2缓冲液1.2m1蒸馏水7.3mlTEMED(四甲基乙

4、二胺)0.01ml10%过硫酸铵溶液0.5m1(加入过硫酸铵轻轻混合后即开始聚合。因此,装柱要求在5min内完成。)2、装柱：迅速用吸管吸取上述混合液沿管柱注入玻管中,每管0.8ml-1.0ml,随即用滴管经针头沿管壁缓慢加入蒸馏水约0.5cm高度以隔氧，室温静置30min,4在凝胶表面与水之间出现清晰的界面，表示凝胶聚合己完成，倒去水层，用滤纸条轻轻吸去凝胶表面水分，注意不能损伤已聚合的凝胶表面。3、样品制备与加样：取血清0.2ml,加苏丹黑B丙二醇液0.02ml,加25%蔗糖溶液0.02ml,混匀,室温放置45min后,2000r/min离心5min

5、。然后取预染血清50μl,加在凝胶面上,再沿管壁缓慢加入电泳液直至管的顶端。4、电泳：将加样的凝胶玻管从橡皮座上取下，插入带孔的电泳槽中，塞紧。不能漏水，凝胶管必须垂直。在上下两槽中分别注入电泳缓冲液，上槽接负极，下槽接正极，电流为2～5mA/管，待第一色带到达胶管下段约1cm时停止电泳，一般需20～30min。5、剥胶：将上槽缓冲液倒出（装于另一瓶内），将凝胶管取下。取一支带长针头（约10cm)的2ml注射器；吸满蒸馏水，将针头从浓缩胶一端小心地沿管壁插入其与凝胶之间，转动玻管，同时注入蒸馏水，使胶柱随水的压力及润滑作用从玻管中脱出。必要时在针剥后用洗

6、耳球从一端缓慢吹出。6、观察与作图：肉眼观察各区带的颜色深浅宽窄及其排列顺序，绘图记录之。三、注意事项1、丙烯酰胺和甲叉双丙烯胺是神经性毒剂，过硫酸铵为有毒成份，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触（漏胶时不要用手接触）。大量操作时应在通风橱中进行。2、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，置冰箱内(4℃)保存。可贮存1~2月。测定pH值(4.9~5.2)可检查其是否失效。失效液不能聚合。3、TEMED要密封保存，过硫酸铵溶液最好当天配制，以防止氧化失效。4、配胶取样要准确，最后加过硫酸铵，加完后轻轻混合（关键）；5、配好胶后应于尽快灌胶（不要形成

7、气泡），5分钟内完成装柱，清洗仪器；6、切记装柱后立即用蒸馏水封闭；7、灌胶和电泳时要注意排除气泡；8、加样时注意不能损伤已聚合的凝胶表面；9、电泳时凝胶管不能漏水,并且与电泳槽垂直；10、凝胶和滤纸请放入垃圾桶中，勿直接倒入水池；411、电泳时间不能过久，待第一条色带到达玻璃管下端约2cm时停止电泳，否则色带会变宽。四、思考题1、正常空腹血清脂蛋白电泳可出现哪些区带？将本实验的电泳图谱与血清琼脂糖凝胶电泳图谱比较并解释。2、聚烯酰胺凝胶电泳分离出的各种血清脂蛋白是否为均一物质？为什么？小结实验利用聚烯酰胺凝胶作电泳支持物。电荷和分子大小不一的各种血清蛋

8、白质通过浓缩效应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。由于具有以上三种效应，所以