仪器分析 高效液相色谱法

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1、第17章HPLC法17.1内容提要17.1.1基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。也称为梯度淋洗。低压梯

2、度──又称外梯度，特点是先混合后加压。它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。液固吸附色谱法──以固

3、体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。分配系数较大的组分保留值也较大。正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一

4、、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。化学键合相色谱法──采用化学键合固定相的液相色谱方法。它分为正相和反相键合相色谱法。离子交换色谱法──以离子交换树脂为固定相，水溶液为流动相，利用待测样品中各组分离子与离子交换树脂的亲和力的不同而进行分离分析的液相色谱分析法。凝胶色谱法──以多孔性凝胶类物质为固定相，以水溶液或有机溶剂为流动相，根据不同组分分子体积的大小进行分离分析的液相色谱分析法。也称为尺寸排阻色谱法。17.1.2基本内容1.高效液相色谱仪的组成不论何种类型高效液相色谱仪，基本上分为四个部分：高压输液系统、进样系统、分离

5、系统和检测系统。(1)输液系统包括贮液罐、高压输液泵、梯度洗脱装置等。(2)进样系统是将待分析样品引入色谱柱的装置，包括取样、进样两个功能。(3)分离系统主要是指担负分离作用的色谱柱，它是色谱仪的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快等。(4)检测系统中的检测器可分为通用型检测器(对样品和洗脱液总的物理化学性质有响应)和选择型检测器(仅对待分离组分的物理化学性质有响应)。2.高效液相色谱法的特点分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广。3.高效液相色谱法几种分离模式的分离原理及其应用高效液相色谱法按组分

6、在两相间分离机理的不同主要可分为：液固吸附色谱法，液液分配色谱法，化学键合相色谱法，离子交换色谱法和凝胶色谱法(体积排阻色谱法)。各类型的分离原理以及应用如下：模式分离原理应用液固吸附色谱利用组分在固定相上的吸附能力不同而分离，采用非极性或弱极性流动相，保留值取决于官能团的类型和数目分离几何异构体，不同族化合物以及用于纯化制备液液分配色谱根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。分配系数较大的组分保留值也较大最适合同系物组分的分离正相键合相色谱利用组分在极性键合固定相与弱极性或非极性

7、流动相之间分配系数不同而分离，流动相极性增大，保留值降低分离中等极性化合物反相键合相色谱采用非极性键合固定相和以水为底溶剂的极性流动相，利用非极性基团的疏水作用和极性基团在流动相中的二次化学平衡，如形成离子对、手性包络物、酸碱平衡等进行分离可分离极性较小的样品，若利用二次化学平衡，可分离离子、离子型化合物，包括强酸强碱离子交换色谱及离子色谱组分离子与固定相平衡离子进行动态交换，根据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离的目的离子、离子型化合物或者在一定条件下可解离的化合物凝胶色谱以孔径一定的多孔凝胶为填充剂，样品按照尺寸

8、差异进行分离。小分子保留值大，大分子保留值小。根据孔径尺寸范围不同，有一定的相对分子质量分离范围高分子、生物大分子等4.高效液相色谱法的应用和局限性HPLC具有高压、高速率、高效率、高灵敏度等特点，广泛应用于卫生检验、环境保护、生命科