'13c代谢通量分析的介绍，改良和应用研究

《'13c代谢通量分析的介绍，改良和应用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、中国科学技术大学博士学位论文<'13>C代谢通量分析的介绍，改良和应用姓名：申铁申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：施蕴渝20100428 摘要摘要近十年来，系统生物学的概念和理论得到了迅速的发展，系统生物学的研究在各处如火如荼地开展。系统生物学的核心便是要整合各个层面，各个构成要素的知识。这些层面当中，除开耳熟能详的基因组，转录组，蛋白质组和表型组外，代谢组(Metabolome)和通量组(Fluxome)成为越来越重要一个组成部分。对这两个体系的研究产生两个新的组学，一个是代谢物组学(Metabonomics)，一个是代谢通量组学(Fluxomics)。前者重点

2、对目标体系内的所有代谢物进行定性和定量，而后者则重点对目标体系内的代谢通量的速率的方向和大小进行测定。这些信息对刻画生物系统的生理特性、评估遗传和环境对细胞的影响具有重要意义。另一方面，通过识别特定的遗传操作和环境条件的控制，以增强生物技术过程的产率及生产能力的现代代谢工程也在快速发展中。代谢工程一个前提就是要量化代谢通量并将其与工程分析方法和分子生物学综合技术结合。因此，这也对通量组(Fluxome)学的发展提出了更高要求。代谢通量组学的主要研究手段是代谢通量分析，它可以分为纯计量性代谢通量分析和13C代谢通量分析两种。其中13C代谢通量分析是近十多年来，国际上新发展并仍然处于发展

3、当中的技术。它除开具有纯计量性代谢通量分析的能力外，还具有获取信息更多，适用范围更广的优点。它能获得代谢途径的交换通量，并且不依赖于除稳态假设外的其他生理假设，因而适用各种试验条件。国内已经有很多家单位开展了代谢物组学和纯计量性代谢通量分析的研究，并取得了不错的结果。但是对于13C代谢通量分析技术，国内还未见有博士论文专题研究。本博士论文的内容主要分成三部分，分别是介绍13C代谢通量分析平台，对13C质量同模子检测技术进行了发展，并利用13C代谢通量分析研究了大肠肝菌在超氧化应激情况下中心代谢通量的变化情况，得到一些有趣的结果。论文的第一章阐述了13C代谢通量分析平台的建立。这包括1

4、3C代谢通量分析的理论综述和实验平台建立描述。I 摘要第一章的第一部分详细介绍了13C代谢通量分析的基本理论。代谢通量分析的基础是代谢通量拟稳态假设。在此假设基础上，可以建立各个代谢物的物质平衡方程。13C代谢通量分析实验在培养底物里引不完全13C标记。13C会分布到所有代谢物中，而由于13C在代谢物中数量和位置的不同，可以得到同一种物质的不同的13C同模子和质量同模子(同模子的一类特殊组合形式)。从同模子概念出发，通过原子转移矩阵和同模子转移矩阵，可以将物质平衡方程推广到同模子守恒方程。通过对中间代谢物建立同模子守恒方程组，可以得到代谢通量相对通量和代谢物的同模子分布之间的确定但是

5、隐式关系。这个关系是一个较为复杂的多元二次方程组。当我们测量了同模子分布的信息，依据此大规模的方程组和参数优化的数值方法，可以反推出代谢通量相对通量。同时，通过构建理论的测量值空间，利用MonteCarlo采样，仿照此求解过程，可以估计代谢通量的置信区间。第一章的第二部分详细介绍了13C代谢通量分析的检测技术对于估计最后的代谢通量而言，我们需要获取两方面的信息。一方面是关于同模子比例的信息。通过核磁波谱，可以获得特定的同模子组合的比例信息。这包括非恒时的HSQC脉冲序列，它主要用于测量，单键相连接的13C异构体组合；HSQC(HMQC)-TOCSY，用于测量包含多个键的C异构体组合。

6、通过质谱，可13以测量质量同模子比例的信息。另一方面是关于代谢物流出代谢体系的量值信息。一部分中间代谢物的流出量值通过细胞的生物质的质量和成分构成；还有一部分中间代谢物的流出量值，通过测量这些中间代谢物在培养液中的残留浓度来获取。论文的第二章阐述了对13C质量同模子检测技术所作的改进，改进后的方法可以提高质量同模子比例的测量确度，从而提高13C代谢通量分析的准确度。第二章的第一部分详细介绍了用质谱进行13C质量同模子检测的基本假设，并对该假设进行了数学化的描述。利用该数学描述，对之前的各种提高质谱测量确度的方法进行了分类和描述。这些方法分可分为线形插值，构建非线性对应关系，以及进行理

7、论修正等几类。这些方法都有非常明显的效果，但有一个共同的缺点，就是只针对某一种特定类型的质谱，不具有普适性。II 摘要第二章的第二部分又分两块，第一块是关于如何提高13C质量同模子检测确度的方法。利用已知了同模子比例的样品，作为标准样，制作任意质谱仪的校准曲线，是一种最具有广泛性的提高测量精度的方法。我们使用以甲醇作为碳源的嗜甲基菌Methylobacteriumsalsuginissp.，将其在排除了天然CO2的环境下，以13C标记的甲醇作为唯一碳源培养