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《应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、第40卷第4期海洋与湖沼Vol.40,No.42009年7月OCEANOLOGIAETLIMNOLOGIASINICAJuly,2009应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类*病毒性出血性败血症病毒(VHSV)113①223倪穗余晓巍王建平雷爱莹曾地刚吴雄飞(1.宁波大学生命科学与生物工程学院宁波315211;2.广西水产研究所南宁530021;3.宁波市海洋与渔业研究院宁波315012)提要参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进
2、行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化。结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带。巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致。该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA。初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段。关键词病毒性出血性败血症病毒,巢式逆转录聚合酶链反应,检测中图分类号Q789病毒性出血性败血症(viralhemorrhagicseptice-家,过去VHS主要流行于北美洲和欧洲一些
3、国家(demia,VHS)是感染鲑鳟鱼类的一种严重的致死性传染Kinkelinetal,1995)。近年来,随着水生动物及其产性疾病。VHS的病原是病毒性出血性败血症病毒品进出口贸易的急剧增加,VHS已经传入我国,并在(VHSV),属于弹状病毒科Novirhabdovirus属。病毒我国局部地区流行(牛鲁祺等,1988)。基因组为一段单链负链RNA,其线性基因组编码5传统的病毒细胞培养法和血清学法均受限于各个蛋白,包括：核衣壳蛋白(N蛋白),两个结构蛋白自的特点,检测费时费力,难于满足快速检测的需要(M1和M2蛋白),糖蛋白(G蛋白)和RNA聚合酶(L(Vers
4、trepenetal,2001)。因此,探讨其快速诊断方法,蛋白)。VHSV粒子长约180nm,宽约70nm。其基因对病毒性出血性败血症病毒的疫情监控及流行病学组长度约12k个碱基(史成银等,2003)。调查,从而采取相应的防治措施具有重要意义。为此,VHSV可以感染大菱鲆、鲈鱼、漠斑牙鲆、虹鳟、本文在病毒性出血性败血症病毒糖蛋白基因序列两褐鳟、茴鱼、白鲑和大西洋鳕鱼等多种鱼类,死亡率端设计两对引物,建立巢式逆转录聚合酶链反应检可达到90%—100%,其危害性很大,2006年5月,研测该病毒,并对其反应条件进行优化,证实了该方法究人员与纽约环保局(DEC)合作,
5、于圣劳伦斯河流和快速,灵敏,具有良好的特异性。爱恩得库特海湾大量死亡的刺鰕虎鱼身上成功分离l材料与方法了该病毒。在国际动物卫生组织(OIE)和我国进境动物一、二类传染病名录中均被列为必报疫病(世界动1.1材料物卫生组织,2000)。国际组织通常对VHSV国家处以VHSV由本实验室保存。VHSV注射感染大菱鲆一些限制措施,从而避免鱼类流动到其他地区和国(Scophthalmusmaximus),出现典型病毒性出血性败*宁波市重大科技攻关项目,2008C10022号;国家科技支撑计划项目,2007BAD43B05号;广西科技攻关项目,桂科攻0718003-3号。倪穗
6、,教授,E-mail：nisui@nbu.edu.cn①通讯作者:王建平,研究员,E-mail：wjping805@126.com收稿日期:2008-11-12,收修改稿日期:2009-03-12490海洋与湖沼40卷血症后,将病鱼保存于－80℃备用。RT-PCR一步法醇。室温干燥。然后加入20μlDEPC处理过的水溶解试剂盒购自Promega公司,TrizolRNA抽提试剂,沉淀,贮存于－20℃待用。pMD18-T载体、Taq酶、dNTP购自上海生物工程公1.4巢式RT-PCR司,其他常规试剂均为国产分析纯。外引物的扩增采用一步法的RT-PCR试剂盒进1.2引
7、物设计行。用TaKaRa产的onestepRT-PCR试剂盒及外引物参照GenBank内VHSV的糖蛋白基因序列将总RNA的逆转录及第一轮PCR扩增在同一管中进(GenBank登录号：DQ401193),用Primerpremier5.0行。反应体系为50μl,其中包含：AMV/Tf15×软件设计了内、外两对引物,由上海生物工程公司合ReactionBuffer10μl,dNTPsMix(10mmol/Leach成。dNTP)1μl,25nmol/LMgSO42μl,AMVReverseTran-scriptase(5U/μl)1μl,TflDNAPolymer
8、ase(5U/μl)1μ
