纳米材料在蛋白磷酸化分析中的应用浅析

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1、纳米材料在蛋白磷酸化分析中的应用浅析大的比表面积、丰富的键合位点、良好的生物相容性和催化活性以及独特的结构，为高灵敏、高选择性生物分析提供了动力，在DNA分析酶传感、生物小分子的检测等领域被广泛应用，同时也为蛋白磷酸化分析带来新的机遇。基于选择性识别或捕获磷酸化的肤段或蛋白的主要机理，综述了近几年纳米材料在磷酸化肤段的富集和信号放大方面的应用，及其在高灵敏蛋白磷酸化分析中的研究进展并进行了展望。1磷酸化肤段或蛋白的富集及信号放大机理1.1基于纳米材料的富集机理为排除非磷酸化的肤段或蛋白的干扰，选择性识别或

2、捕获磷酸化的肤段或蛋白是非常重要的一步。利用纳米材料选择性富集磷酸化的多肤或蛋白的常见方式是通过化学亲和作用，一种是采用金属氧化物作亲和探针，其中金属氧化物的路易斯酸度是影响金属氧化物亲和性的主要因素①具有最强酸度的金属氧化物，因可与非磷酸化多肤键合，致使检测存在着很严重的非特异干扰。②具有较强酸度的金属氧化物对磷酸化肤存在强的键合力，因为多磷酸化肤不易洗脱，致使优先检测单磷酸的多肤。③具有较低酸度的金属氧化物因与单磷酸化肤弱的相互作用，可选择性地亲和多磷酸化的肤。另一种是金属离子与磷酸根的作用。关于金属

3、离子与磷酸根的相互作用存在着争议，有文献认为金属离子与磷酸根是静电吸附作用，而有的文献则认为它们之间作用力的强度远大于静电作用。1.2基于纳米材料的信号放大机理近几年，信号放大技术尤其是基于纳米材料的信号放大在磷酸化的超灵敏检测中受到了广泛关注。如何既能选择性识别磷酸化肤段或蛋白，又能结合信号放大部分，以实现磷酸化肤段或蛋白检测信号的放大是其关键步骤。较常用的识别或连接方式主要有两类:①生物亲和作用，②化学键合作用。而基于纳米材料信号放大的机理主要归于以下两个方面:①纳米材料作载体。因为纳米材料独特的生物

4、相容性和大的比表面积以及易于修饰的特性，使其非常有利于用作载体以增强探针的量。通常纳米材料作为一个基底元素用来富集目标分子或信号分子，以实现信号的放大。②增强导电性。一般纳米材料的导电性比较优越，因此可加快电子传递的速率，提高信号响应。2基于纳米材料对磷酸化肤段或蛋白的预富集由于非磷酸化多肤的干扰和磷酸化多肤本身的丰度低等问题，导致研究者对蛋白磷酸化位点的鉴定和分析存在很大的困难。因此，对磷酸化的肤段或蛋白进行选择性富集，以提高磷酸化组分的相对含量，降低非磷酸化组分的干扰显得十分重要。纳米材料及其复合物因

5、为价格低，纳米表面易于功能化，与磷酸化肤之间的结合力强，而被广泛用于蛋白磷酸化的富集和分离。1介孔纳米材料近几年，介孔材料在纳米科学领域中占据重要的地位，基于其独特的微纳米尺寸效应，如大的比表面积、多孔结构等，介孔材料被应用于不同的生物领域。金属氧化物纳米粒子因独特的表面效应、超顺磁性、小尺寸效应和量子隧道效应等特性，使其表面易于富集磷酸化多肤。早期的研究主要是将单一的纳米金属氧化物填充在柱体中或移液器吸头内进行磷酸化肤段的预富集。201X年，Ge等首次将制备的介孔二氧化错纳米材料用于高效选择性富集磷酸化

6、的肤段。与纳米金属氧化物材料相比，介孔纳米材料因其超大比表面积以及许多活性位点，而具有更强的键合磷酸根的能力。随后，介孔二氧化钦和介孔二氧化铅纳米材料也被用于磷酸化肤的富集。研究表明，介孔二氧化铅和二氧化错在复杂样品中富集磷酸化肤段的能力优于介孔二氧化钦纳米材料。虽然，介孔金属氧化物纳米材料在富集磷酸化多肤方面优于金属氧化物材料，但其过深的孔道结构可能导致目标多肤富集和释放困难。在己报道的富集技术中更倾向于单磷酸化肤段的富集，而导致多磷酸化肤段的信息丢失，不利于对其全面的了解和研究。针对这个问题。用ZrP

7、修饰的介孔硅材料选择性捕获磷酸化的肤段并运用质谱进行分析。该材料因表面与多磷酸化肤段的结合力更强而优先富集多磷酸化的肤段。刘宝红课题组也将功能化的介孔材料应用于多磷酸化肤的富集，发展了新型的针对多磷酸化肤段的富集方法，该研究组用湿润注入法在硅介孔材料表面修饰二氧化钦，制备了一种基于二氧化钦修饰的介孔硅材料。介孔材料大的比表面积及其良好的微纳尺寸效应，加快了溶液体系中介孔材料和多肤之间的吸附。同时又因为二氧化钦修饰于介孔材料之后，在其表面形成大量的不饱和的4配位钦物种，易与磷酸基团形成双齿鳌合，且更倾向于发

8、生在多磷酸化肤段中，使多磷酸化肤段优先选择吸附，检测信号显著提高。该研究组还构建了一种微纳反应器，先制备大孔有序的氧化铝功能化的氧化硅泡沫材料，然后将蛋白酶固定在该泡沫材料上，该反应器己被应用于磷酸化多肤的分析。具有大的孔径和比表面积，既可实现原位酶解又可发生原位磷酸化。将A1-MOSF直接加入到溶液中时，酶和蛋白质会迅速富集到孔穴中以达到蛋白质的快速水解，同时又吸附固定磷酸化的多肤在其孔穴中，而非特异性的肤段被释放到溶液中。