实验方法-aflp实验操作指南

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1、AFLP实验操作指南一、实验操作流程1．DNA样本的准备把DNA样本用紫外光（或荧光）分光光度计精确的测取浓度，然后将其稀释成浓度为50ng/ul，体积为50ul的溶液，如果DNA样本不多，在保证浓度的情况下体积可以适当减少。2．DNA酶切（1）反应体系成分体积（ul）双蒸水11.4缓冲液（Yellowbuffer）4EcoRI(10u/ul)0.5MseI(10u/ul)0.1模板DNA（50ng/ul）4总体积20（2）反映程序37℃反应3个小时，最后保存于4℃。（3）检测取4－6ul酶切液进行酶切效果检测，跑出的带以弥散状、无明显主带为好。琼脂糖电泳用6×loadingbuff

2、er：名称用量（武汉）用量（广州）Ficell400（蔗糖）12g40gEDTA(0.5MPH=8.0)12ul10%SDS（十二烷基四磺酸钠）6mlBromphenolBlue（溴酚蓝）25mg25mgXyleneCyanoleFF（二甲苯青FF）25mg25mgddH2Oaddto100ml100ml3．连接接头（1）接头的制备a、按公司说明书将引物单链稀释成高浓度(一般是5OD稀释成1650ng/ul)溶液储存于－20℃冰箱。b、取部分引物单链稀释成100uM/l，然后两条正反单链混合，体积比如下：10ulEcoR1正链、10ulEcoR1反链和180ulTE混合成200ulE

3、coR1接头；100ulMseI正链、100ulMseI反链混合成200ulMseI接头。c、反应程序：95℃下5min，65℃下10min，37℃下10min，25℃下10min，保存于4℃。最终储存于－20℃冰箱。（2）连接反应体系成分体积（ul）双蒸水7.6反应缓冲液（T4DNA连接酶自带）2.5EcoR1接头1MseI接头1T4DNA连接酶（5u/ul）0.4酶切反应后溶液12.5总体积25（1）反应程序21℃保存过夜。附：酶切和连接之间不要停止。（2）稀释按1：10的比列稀释，已稀释的和未稀释的均可长时间储存于－20℃备用。实验进行到此处可以暂停。2．预扩增（1）反应体系成

4、分体积（ul）双蒸水10.3缓冲液（10xTag酶自带）2dNTPs(10Mm)0.4EA00(50ng/ul)1MC00(50ng/ul)1MgCl2(25mM/l)(Tag酶自带)1.2Tag聚合酶（5u/ul）0.1稀释后已连接DNA模板4总体积20（2）反映程序a、94℃2minb、94℃30sc、56℃1mind、72℃1mine、重复b～d25次f、72℃5ming、保存于4℃（3）稀释取部分预扩增后溶液按1：25的比例稀释(稀释比例可以自己适当调整)。将已稀释的和未稀释的保存于－20℃储存。实验进行到此处可以暂停。（4）检测取未稀释的预扩增产物4－6ul进行琼脂糖电泳检

5、测。3．选择扩增（1）反应体系成分体积（ul）双蒸水1.6缓冲液（10xTag酶自带）1dNTPs(10mM)0.2EA--(15ng/ul)*2MC--(15ng/ul)*2MgCl2(25mM/l)(Tag酶自带)0.6Tag聚合酶（5u/ul）0.1预扩增稀释后模板2.5总体积10*:EA--,MC—后面两个碱基因不同引物对而不同。（2）反应程序a、第1个循环：94℃4min,94℃30s,65℃1min,72℃1min；b、第2～13个循环：94℃30s,65℃1min,72℃1min（退火温度每隔一个循环降低0.7℃）；c、第14～36个循环：94℃30s,56℃1min,

6、72℃1min；d、72℃5min,4℃保存。6．变性（1）变性剂（Loadingbuffer）配方组分体积去离子甲酰胺（DeionizedFormamide）50mlEDTA(0.5MPH=8.0)1ml二甲苯腈FF(XyleneCyanoleFF)0.125g溴酚蓝（BromphenolBlue）0.125g（1）变性将3/4体积（或者1/2即可）的变性剂加入PCR反应产物，95℃变性5min，立刻保存于4℃或置于冰上直到上样电泳。（3）新的变性剂配方组分体积终浓度去离子甲酰胺（DeionizedFormamide）95ml95%溴酚蓝（BromphenolBlue）50mg0.

7、05%二甲苯腈FF(XyleneCyanoleFF)50mg0.05%NaOH(100M)1ml(或直接称0.04g)1M7.制胶溶液（1）一块胶的配方将12ml5XTBE和25.2g尿素（Urea）混合加水定容至51ml，向其中加入9ml40％的丙烯酰胺溶液，400ul10%过硫酸胺（APS）和30ul四甲基一二胺（TEMED）。（2）各组分配方5XTBE：54gTris碱（Tris-base）,27.5g硼酸（B-acid）和20mlEDTA(0.5M