流式细胞术样品制备技术

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1、流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；

2、②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、

3、结构、功能等。所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。（一）酶消化法1作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白

4、和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。2注意事项：①酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使用浓度和消化时间；③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等；④要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。3方法学程序（1）将适合于酶消化的组织置于离心管中；（2）将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中；（3）一般消化20-30分钟（恒温37℃或

5、室温），消化期间要间断振荡或吹打；（4）终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速成离心除去细胞碎片；（5）将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。（二）机械法机械法分散实体组织包括：用手术剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织，用匀浆器匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。1剪碎法：①将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；②用剪刀将组织剪至匀浆状；③加入10ml生理盐水；④用

6、吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；⑤离心沉淀1000prm,3-5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500-800prm）短时离心沉淀去除细胞碎片；⑥以300目尼龙网滤去细胞团块；⑦细胞用固定液固定或低温保存备用。2网搓法①将100目，300目尼龙网扎在小烧杯上；②把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；③收集细胞悬液，离心沉淀500-800prm，2分钟；④固定细胞或低温保存备用。3研磨法准备一只70ml研磨器。①先将组织剪成1-2mm3大小组织块；②放入组织研磨

7、器中加入1-2ml生理盐水；③转动研棒，研至匀浆；④加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；⑤收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800prm，1-2min，再以生理盐水洗3遍，离心沉淀；⑥固定或低温保存细胞悬液，备用。（三）化学处理法1作用原理化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。2试剂的配制①0.2%EDTA配制：称EDTA0.2g，加入Hankˊs液100ml，封装高压消毒。置0℃-4℃保存；②胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g加PBS（pH7.0）200ml，浓度0.125%，

8、EDTA0.2g加PBS（pH7.0）100ml，浓度0.2%。各取40ml混合，分装置冰箱保存，用时过滤即可使用。3实验方法①将组织切成薄片，置入试管中；②首先加入EDTA液5ml，室温下0.5h，离心弃之；③再加入胰酶-EDTA液