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1、环境工程微生物学实验指导实验四微生物的大小测量、微生物的计数一、实验目的和要求1.了解测微尺的构造和原理,学习接目测微尺的校正方法及微生物大小的测定。2.学习利用血球计数板对微生物进行计数的原理和方法。二、实验原理微生物细胞的大小是微生物形态特征之一.也是分类鉴定的依据之一.其大小的测量是在显微镜下用接目测微尺来测量.由于在目镜中观测到的是显微镜放大后的物像,又因为放大倍数不同时,目镜测微尺每格实际代表的长度也随之变化,因此目镜测微尺在使用前必须用标准物镜尺进行校正.接目测微尺是一块圆形玻璃片,其中央尺等分成100格.物镜测微尺又称标准尺.是一块中央
2、刻有精确刻度的载玻片,放在载物台上使用的,专用于校正接目测微尺.常用的是0.01毫米物镜测微尺.是将长1毫米的直线等分成100个小格,每格长度即为0.01毫米(10微米),利用血球计数板在显微镜下直接计数,是一种常用的微生物计数方法.此法是将单细胞微生物的菌悬液或孢子悬液,注入血球计数板与盖玻片之间的计数室中,在显微镜下在进行计数的.由于计数室的容积是一定的,所以可根据显微镜下观察的微生物的数量计算出单位体积内的微生物总数.血球计数板的计数室如下图所示,其中央为计数室,通常有两种规格25×16型或16×25型.常用的为25×16型,其长和宽各为1毫米
3、,盖上盖玻片后,其间的距离为0.1毫米,因此计数室的容积为0.1立方毫米.细胞数（CFU/mL）=50000×A×B式中：A－5个中方格中细胞总数B－菌液的稀释倍数血球计数扳的构造a.平面图(中间平台分为两半，各刻有一个方格网)b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙)第4页共4页环境工程微生物学实验指导血球计数板计数网的分区和分格三、实验材料和器材1、菌种:固体斜面培养18-24小时酵母菌2、培养基及试剂:马铃薯固体培养基、二甲苯、95％乙醇、苯酚等3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭
4、菌手推车、血球计数板、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、盖玻片、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、圆塑料篓、长塑料篓、血红蛋白吸管、10mL塑料离心管、物镜物镜测微尺、目镜测微尺等四、实验操作步骤一）微生物大小测量1.校正目镜测微尺：将目镜头上的透镜旋下，把目镜测微尺裝入镜筒内，在显微镜里看到目镜测微尺的刻度。将物镜测微尺放在载物台上，有刻度的一面朝上，切勿放反了。调整光线后，先在低倍镜下找到物镜测微尺的尺子。然后转高倍镜观察到两把尺子，调节目镜测微尺，使两把尺的刻度线平行。再调节物镜测微尺，使目镜测微尺的一条刻度线与物镜测微尺上的一条刻度线重合，再寻找
5、另一重合线，分别数出物镜测微尺及目镜测微尺的格数。以此计算在此放大倍数下目镜测微尺每一小格所代表的实际长度。例如：物镜测微尺的10格内含有目镜测微尺共45格，此物镜测微尺内有10小格，所以目镜测微尺每小格代表的实际长度＝10格×10微÷45格＝2.2微米。目镜测微尺每小格代表的实际长度（微米）＝第4页共4页环境工程微生物学实验指导2.测量微生物菌体的大小：将物镜测微尺取下，把自制的酵母菌水浸片放于载物台上，通过旋转目镜筒的方法测出酵母菌菌体的长和宽，应测量5个菌体（先数格数，后计算）。二）微生物的计数1.在无菌操作条件下取一小环酵母菌于塑料试管中摇匀
6、。2.取一块干净的血球计数板,在显微镜下用低倍镜找到中央计数室.上升镜筒,将盖玻片盖在计数室上。3.用吸管吸取酵母菌菌悬液(先将菌液摇匀一下),将滴管在血球计数板和盖玻片之间的缝隙间靠一下,菌悬液即被吸入计数室内,用手轻压盖玻片,以免溶液过多而改变了计数室的体积,用滤纸吸取多余的菌液,静止一会,让菌体自然沉降并且稳定下来。4.计数:分别统计五个中方格的酵母菌的数量和出芽的酵母菌数量.取计数室右上,右下,左上,左下,中央的五个中方格.压线的菌以取上不取下,取左不取右的菌计数原则计数。5.计完后取下盖玻片,用蒸馏水洗净血球计数板,用滤纸吸干净水份后,盖上
7、干净的盖玻片,再滴菌液,于显微镜下重复计数二次。6.使用完毕后应将计数板用清水冲洗干净，待自行晾干或用电吹风吹干后装入盒中。五、实验结果记录及计算一）微生物的大小测量1.校正目镜测微尺：在16（10）×40下两重合刻度的格数：目镜格数＝物镜格数＝目镜测微尺每小格代表的实际长度（微米）＝2．酵母菌列表记录于下。酵母菌编号酵母菌占目镜测微尺的格数计算（微米）1长宽2长宽3长宽4长宽5长宽总结：酵母菌的平均长度为。平均宽度为。最大的酵母菌的长为。其宽度为。最小的酵母菌的长为。其宽度为。二）微生物的计数：测定次数中方菌格编数号第一次第二次第4页共4页环境工程
8、微生物学实验指导左上右上右下左下中间酵母菌总数计算:每毫升菌液中含酵母菌的个数:六、实验结果分析及问题讨论第
