硕士学位论文_hiv-1_tat38-61(51n55n)碱性区突变体库的构建及亲和筛选

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1、硕士学位论文HIV-1Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体库的构建及亲和筛选ConstructionofHIV-1Tat38-61(51N/55N)BasicRegionMutationLibrariesandAffinityScreening独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法

2、律责任。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文使用授权书声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日第二军医大学硕士学位论文目录目录中文摘要1ABSTRACT5缩略词表10前言11

3、第一部分HIV-1TAT(38-61)融合蛋白的表达及免疫原性分析131.实验材料152.实验方法203.实验结果234.讨论27第二部分HIV-1TAT38-61(51N/55N)碱性区突变体库的构建291.实验材料312.实验方法333.实验结果364.讨论40第三部分HIV-1TAT38-61(51N/55N)碱性区突变体库的亲和筛选421.实验材料432.实验方法433.实验结果454.讨论47总结49综述50参考文献55附录个人简历57致谢58-57-第二军医大学硕士学位论文中文摘要中

4、文摘要人类免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus，HIV）归属于逆转录病毒科中慢病毒属，主要经血液、性接触及母婴垂直途径等传播，可引起获得性免疫缺陷综合症（AcquiredImmuneDeficiencySyndrome，AIDS），即艾滋病。目前，艾滋病感染已经成为全球所面临的重大公共卫生问题。研制有效的HIV疫苗是艾滋病防治的重要手段之一。因此，探索HIV疫苗研究的新策略和寻找新的疫苗靶点对疫苗的成功研发显得尤为重要。HIV-1反式激活蛋白(Trans-activ

5、atoroftranscription，Tat)是HIV感染早期产生的一种重要调控蛋白，在HIV-1的复制、扩散和致病中起重要作用。HIV-1感染靶细胞后，胞质中合成的Tat转移到核内，与多种转录调控因子结合组成转录起始复合体（transcriptioninitiationcomplex,TIC）,促进病毒RNA的转录、延伸和病毒复制。此外，Tat还可被感染细胞通过多种方式分泌到胞外发挥“病毒毒素”的作用：①通过诱导CD4+T细胞、NK细胞或B细胞的凋亡，发挥其免疫抑制的作用；②通过JAK/ST

6、AT信号转导途经激活HHV-8的复制，或通过RGD(Arg-Gly-Asp)与内皮细胞αvβ3和α5β1整合素结合，与可溶性炎症因子和血管生成因子协同促进卡波济肉瘤（Kaposi’ssarcoma,KS）的形成；③通过影响神经细胞钙流，诱导巨噬细胞和小胶质细胞表达TGF-β、TNF等神经毒性物质，发挥神经毒作用，促进艾滋病脑病的发生。Tat碱性氨基酸富集区(49-57aa)是Tat的穿膜和核定位功能基序，是Tat蛋白的主要中和表位之一。其中和抗体可消除Tat分子所特有的穿入其他细胞发挥毒性的核心

7、功能，从机制上能对阻止艾滋病和免疫抑制的发生有重要作用。此外，Tat碱性区序列在各亚型间高度保守，有利于产生交叉反应谱更广的抗体。本研究拟利用噬菌体展示技术分子进化平台，对天然Tat碱性区进行重组改造和筛选，构建由碱性区突变片段经随机连接肽相互连接的重复串联的噬菌体展示文库，用含有高中和活性的抗-Tat兔抗血清进行进化筛选，获得新型免疫原的代表性序列。本研究分以下三部分进行：一、HIV-1Tat(38-61)融合蛋白的表达及免疫原性分析功能研究表明：Tat蛋白碱性区（49-57aa）介导Tat蛋

8、白穿膜，与Tat细胞外活性密切相关。-57-第二军医大学硕士学位论文中文摘要结构研究表明：Tat分子为天然非折叠蛋白，属于无规则卷曲类型的分子，缺乏稳定的二级结构和高级结构，其分子构想极不稳定，出于快速动态的变化之中，导致以Tat作为抗原，刺激效果差，高亲和力的抗体较少且容易被降解。此外，Tat碱性区只有9个氨基酸（49-57aa），为了不破坏其中和表位，我们保留了Tat核心区（38-48aa），将Tat的38-61碱性区片段构建到原核表达载体，纯化出Tat(38-61)融合蛋白并检测其免疫原性