适用于竹林土壤pcr_dgge分析用的微生物总dna提取及纯化方法

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1、适用于竹林土壤PCR-DGGE分析用的微生物总DNA提取及纯化方法摘要：为了获得完整、高纯度的竹林土壤微生物总DNA，采用改良的十二烷基硫酸钠-高对5种竹林土壤进行DNA提取，通过DNA凝胶回收试剂盒纯化粗提的DNA，利用细菌16SrDNA基因的V3区引物对纯化的DNA进行了聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）验证。结果表明，该方法所需土壤样品少，抽提的DNA片段均在23kb以上，完整性好；采用DNA凝胶回收试剂盒纯化能够有效去除粗提DNA中大部分杂质，获得高质量的DNA；以此DNA为模板进行DGGE检测所反映的微生物信息量丰富。变

2、性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）技术从1993年被引入微生物生态学以来，已经普遍应用于微生物研究，成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具之一［1］。获得样品中所有种类微生物的DNA是应用DGGE技术的前提和关键。然而，来自环境中的样品含有非常复杂的成分，尤其是土壤中的腐植酸类物质很难去除。另外，实际样品中微生物细胞壁的坚实度不同，如不注意就会选择性地获得那些易破细胞壁的微生物DNA，而且有些样品DNA回收率低，造成重复性降低［2］。因此，需要摸索适合具体样品的DNA提取方法

3、。近30a来，国内外在这方面作了大量研究，如Porteous等［3］使用加热-酶-异硫氰酸胍裂解细胞提取总DNA；Zhou等［4］使用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠（SDS）破解细胞提取总DNA。这些方法提取的土壤微生物DNA产量高，但杂质也多，其中以腐植酸污染最为严重，直接影响后续聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）实验的准确性。鉴于此，人们又尝试许多方法去除腐植酸的影响，如He等［5］使用磷酸盐缓冲液预洗土壤后再提取DNA，Dong等［6］尝试采用Al2（SO4）3去除土壤DNA中的腐植酸，获得良好效果。目前，针对竹林土壤微生物总DN

4、A提取以及利用PCR-DGGE分析竹林土壤微生物群落多样性的研究还未见报道。笔者拟在以往研究的基础上，通过摸索和改进［4，7-8］，建立一种适应于竹林土壤PCR-DGGE分析用的DNA提取和纯化方法，为进一步研究竹林土壤微生物群落结构和多样性打下良好的基础。1材料和方法1.1材料实验土样于2007年8月取自浙江林学院吉永竹园。分别采集了雷竹Phyllostachyspraecox，紫竹Phyllostachysnigra，刚竹Phyllostachyssulphurea，龟甲竹Phyllostachysheterocycla和黄秆乌哺鸡Phyllo

5、stachysvivax等5种竹林的土壤，采样深度为0~10cm，按五点法采样，四分法混匀放入保鲜袋中，封口后，带回实验室，4℃保存。1.2竹林土壤微生物总DNA提取方法1.2.1粗提首先按照Zhou等［4］报道的SDS高盐抽提法（简称常规法）提取了5种竹林土壤微生物的总DNA，作为对照。采用的改良SDS高盐抽提法（简称改良法）参照常规法修订而成，即在高盐提取液中添加石英砂，以反复冻融代替水浴破碎细胞，并且在氯仿-异戊醇抽提过程增加了NaCl/CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）溶液2次抽提的步骤。具体操作如下：称取1.0g土壤样品，与4.5mLDNA

6、提取缓冲液（Tris-HCl100mmol·L－1，EDTA100mmol·L－1，Na3PO4100mmol·L－1，NaCl1.5mol·L－1，10.0g·kg－1CTAB，pH8.0）混合，加少许石英砂，于230r·min－1摇床上37℃摇动30min；随后加入0.5mL200g·kg－1SDS，混合物于65℃水浴20min（每隔10~15min轻轻上下颠倒几次），－80℃冷冻15min，反复冻融2次。室温6000r·min-1离心10min，收集上清，加入1/10体积65℃预热的NaCl/CTAB溶液（100g·kg－1CTAB，0.7m

7、ol·L－1NaCl）和等体积的氯仿-戊醇，轻摇混匀，室温下10000r·min-1离心6min，吸取上层水相。重复抽提1~2次，吸取水相转移至新离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀15min，10000r·min-1离心10min收集核酸沉淀。用体积分数为70%乙醇洗涤2次，室温风干，用200μLTE缓冲液（10mmol·L－1Tris-HCl，1mmol·L－1EDTA，pH8.0）溶解沉淀，4℃保存。1.2.2DNA的纯化采用DNA凝胶回收试剂盒纯化粗提DNA。具体操作与试剂盒说明略有差异：将粗提的DNA与溶液Ⅰ以3∶1混合，室温放置

8、10min，然后将混合液加入到回收柱中，静置2min，离心。用0.5mL体积分数为75%乙醇清洗2次，最后用100μLTE