单克隆抗体研制最详细步骤

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1、单克隆抗体研制最详细步骤作者：  时间：2008-05-1515:54:24  来源:  生物谷  浏览评论1、单抗的标记目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断（盒）的形式提供，其中核心为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。（1）酶标记A、辣根过氧化物酶（HRP）标记辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与

2、其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。程序一：a.  将5mgHRP溶于0.5ml0.1mol/LNaHCO3溶液中；加0.5ml10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。b.  加0.75ml0.1mol/LNa2CO3混匀。c.  加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。d.  称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外

3、筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。e.  用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20VNaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。f.  将交联物过SephadexG200或Sepharose6B（2.6×50cm）层析纯化，分管收集第一峰。g.  酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量（mg/ml）=OD403×0.4IgG量（mg/ml）=（OD280-OD40

4、3×0.3）×0.62克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。标记率=OD403/OD280酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。h.HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60%

5、甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。程序二：1.将5mgHRP溶于0.3mol/LPH8.1NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的α和ε氨基。2.再加1ml0.06mol/L过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色；随后加1ml0.06mol/L乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。3.移入透析袋中，在1000ml0.01mol/LPH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，

6、更换三次缓冲液，注意避光。4.吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mgIgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2-3小时，避光；加入5mgNaBH4，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/LPH9.5）0.2ml，作用7小时。5.再移入透析袋中，在0.02mol/LPH7.4PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。6.用3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。7.8.步骤同程序一。B、碱性磷酸酶（AP）标

7、记碱性磷酸酶（AP）用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。其程序如下：1.将5mgAP加入1ml抗体溶液（2mg/ml）中溶解，装入透析袋，于4℃对0.01mol/LPH7.2PBS透析18小时，换液三次。2.加入2.5%戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4℃对PBS透析过夜，其间换液三次。3.换用0.05mol/LPH8.0Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换

8、液三次。4.取出标记抗体，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AP标记物原液。5.每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。C、PAP、APAAP的制备PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术）、APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术）的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAP、APAAP供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常