分子生物学技术在中医药研究中的应用 03质粒鉴定与制备

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1、《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（2）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数48专业中医基础和中医临床专业内容质粒转化大肠杆菌、阳性菌落扩增、质粒小量制备时数12本次课目的要求掌握质粒转化大肠杆菌理论与技术。掌握阳性菌落扩增，质粒小量制备理论与技术。本次课的重点难点质粒转化大肠杆菌技术。涂皿鉴定技术。阳性克隆扩增技术。少量质粒制备技术。本次课的应用教具质粒转化大肠杆菌实验及有关仪器设备。阳性菌落扩增，质粒小量制备实验及有关仪器设备。实验26质粒转化大肠杆菌该实验主要有两个用途：1．重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的

2、自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，质粒环化（包括自身环化），抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力，可以含该抗生素的培养基中生长传代，不然，重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。2．为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。（作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。）原理本实验通过CaCl2对特定的

3、大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106~2×107个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。实验准备（略）实验步骤自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃

4、冰箱。细菌50ulDNA5ul轻轻混匀，静置冰上30分钟。于42℃水浴中热休克细菌45秒，迅速移入湿冰中，静置2分钟，加入900ulLB培养液，放入37℃恒温箱摇床，225rpm摇晃培养1小时。分别取50ul和100ul涂于两只含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。次日，检查各培养皿中是否出现菌落。实验结果转化成功，培养皿中可见散在的菌落，其中加入100ul培养液的培养皿中的菌落数约为50ul培养液培养皿的一倍。转化失败，培养皿上无菌落，或菌落布满如苔样，后者提示可能是抗生素浓度不够或失效。注意事项1．本实验采用的质粒含氨卞青霉素的抗性基因，因而

5、采用含氨卞青霉素琼脂板作选择。常用的抗性基因还有四环素、金霉素等，要求明确以准备适宜的抗生素板。2．整个实验须严格按照无菌操作要求进行，由于琼脂板含有抗生素，所以当实验环境干净者，可以直接放在普通实验台上操作。3．接种环或自制玻璃涂棒在煤气灯上消毒后，须冷后方可涂皿。对于那些缺少实验室经验的研究人员，我们建议采用成L型的自制玻璃涂棒，这样由于L型的下端与琼脂板的接触面大，不易将琼脂板划破。4．培养皿在皿底作标记，写明内容、日期、操作者等，倒置放入培养箱。5．感受态大肠杆菌的制备：（1）在无污染的条件下，用LB扩增大肠杆菌，并离心收集。（2）4℃条件下，用0.1mol/LCaCl2重悬

6、沉淀，再离心沉淀，以洗去LB培养液。（3）4℃条件下，用0.1mol/LCaCl2重悬沉淀，分装备用。大约50ml的LB培养液的大肠杆菌，溶于2ml的CaCl2中（每mlLB培养液大约含108成活的大肠杆菌，LB培养的菌落要求划皿约16-20小时的菌落）。实验27阳性单菌落扩增与小量DNA制备目的1．为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒DNA。排除自身环化。鉴定方法主要有：（1）PCR法及其利弊。采用载体两端的引物进行PCR，一旦插入成功，则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的PCR产物。（2）Southernblot法及其利弊。将培养皿上的菌落转移到硝酸纤维素膜上，变性、

7、固定，以插入片段为探针作Southernblot。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见到放射自显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成功者。（3）酶切鉴定法及其利弊。2．提供一定数量的DNA以满足一些实验，比如1）测序、2）准备杂交用的探针。这便是本实验的两个主要目的。有关微型真空柱和离心柱的利弊。原理与本实验近似，区别在于DNA的回收不是采用酒精沉淀，而痕量乙醇，这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续的工作困难。原理挑选单一菌落，培养扩增。离心收集扩增