辛巴蓝f-3ga修饰的啤酒废酵母菌亲和吸附溶菌酶

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1、辛巴蓝F-3GA修饰的啤酒废酵母菌亲和吸附溶菌酶摘要利用三嗪染料辛巴蓝F-3GA修饰经戊二醛交联的啤酒废酵母菌，得到一种新型染料亲和吸附剂。辛巴蓝F-3GA的固载量为161．1mg/g。以溶菌酶为研究对象，考察吸附时间、酶初始浓度、pH值、离子强度等因素对吸附率的影响。结果表明:当pH=7．0时，其对溶菌酶有较高的吸附量(229．1mg/g)，吸附性能明显优于未接枝F-3GA的交联菌。负载的溶菌酶用1．0mol/LNaSCN溶液洗脱，洗脱率高达89．1%，酶活性保持率为91．0%。将其用于鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化，酶活力收

2、得率为73．5%，纯化倍数为26．7。关键词啤酒废酵母菌;辛巴蓝F-3GA;染料亲和吸附;溶菌酶1引言溶菌酶(Lysozyme)是糖苷水解酶［1］，因其可选择性地分解微生物的细胞壁而具有杀菌、抗病毒、抗肿瘤细胞等功效，在食品工业、医疗、生物学等领域广泛应用［2～4］，常用于治疗慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘等疾病［5］。亲和吸附具有高选择性，可从复杂生物体系中高效、快速地分离出相应的目标产品，在蛋白分离纯化过程中有广阔的应用前景。目前，染料配基由于价格低廉，性质稳定，与蛋白结合容量大，已被固定在葡聚糖、琼脂糖、壳聚

3、糖等不同基质上，并成功用于脱氢酶、激酶、水解酶及血浆类蛋白的分离纯化［6～8］。但多数基质性质不稳定，机械强度小，价格昂贵，预处理过程繁琐，而利用戊二醛交联的啤酒废酵母菌作为吸附基质，机械强度高，非特性吸附较小，廉价易得，既可增大吸附剂在实际中的应用范围，降低染料亲和吸附剂成本，还能减轻啤酒废水的处理负荷和难度。啤酒废酵母菌体表面保留了与活菌体相同的可修饰功能团，因而可实现戊二醛交联菌上辛巴蓝F-3GA的接枝，制得一种新型染料亲和吸附剂。本实验考察了该吸附剂对溶菌酶的吸附性能，并将其用于鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化，结果满意。

4、2实验部分2．1仪器与试剂RENISHAWinViaRamanMicroscope(UK);LAMBDAB1035紫外可见分光光度计(美国珀金-埃尔默公司);SHZ-03恒温水浴摇床(上海堪鑫仪器设备有限公司);TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂);BX51荧光电子显微镜(日本奥林巴斯公司);MAXI-DRYLYO真空浓缩(冻干)系统(捷克HETO公司)。啤酒废酵母菌(湖北某啤酒厂);辛巴蓝F-3GA，溶菌酶，溶壁微球菌干粉均购自Sigma公司;其它试剂均为分析纯。2．2实验方法2．2．1戊二醛交联菌与辛巴蓝F-

5、3GA修饰菌的制备取1．5g干燥的啤酒废酵母菌，加50mL蒸馏水，振荡1h，加2mL50%戊二醛溶液，于30℃水浴摇床中振荡反应14h后，以去离子水洗涤，冷冻干燥后得交联菌。在100mL三颈瓶中加入1．0g交联菌，400．0mg辛巴蓝F-3GA，40mL蒸馏水，于60℃水浴中搅拌反应30min。加入4．0gNaCl，反应30min后加入0．4gNa2CO3(调pH≈10．0)继续反应3h，产物趁热第39卷2011年1月分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报ChineseJournalofAnalyticalChemis

6、try第1期91～94抽滤，用水、乙醇和丙酮反复洗涤，40℃真空干燥，得到蓝色修饰菌。2．2．2吸附剂合成条件优化取交联菌0．5g，确定反应液总体积20mL，反应温度60℃，加入0．2g无水Na2CO3，按2．2．1节的方法进行三因素三水平正交实验，反应时间(因素A)为2、4和6h;辛巴蓝用量(因素B)为50．0、80．0和100．0mg;NaCl用量(因素C)为1．0、2．0和3．0g。2．2．3菌体表面形态及拉曼光谱表征用荧光电子显微镜观察交联前后菌体表面形态变化。选择氩离子激光器，激光波长514nm，对修饰前后菌体进

7、行拉曼光谱表征，比较拉曼谱图变化。2．2．4吸附与洗脱实验分别取25．0mg干燥的交联菌与修饰菌各3份，置于3个50mL锥形瓶中，1和2号各加入10mL磷酸盐缓冲溶液，3号加入10mL0．4g/L溶菌酶溶液，放入30℃摇床，130r/min振荡吸附4h，取上清液。以1号作参比，2号加入初始浓度的酶液作对照，用紫外分光光度计测定280nm处的吸光度值，计算酶的吸附量。用不同浓度的NaCl和NaSCN溶液对吸附了溶菌酶的菌体洗脱。在上述移去上清液的3个锥形瓶中各加入10mL洗脱剂，30℃摇床振荡4h后，取上清液，测定溶菌酶含量

8、，计算洗脱率。2．2．5鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化及酶活测定取适量新鲜鸡蛋清液，加入等体积的磷酸盐缓冲液(pH7．0)，搅拌均匀后，以12000r/min离心15min去杂质，取上清液10mL做吸附洗脱实验。并按照文献［9］，在25℃，pH6．2，波长450nm条件下，测定吸附洗脱前后纯酶液与鸡蛋清液的溶