western blotting的protocol

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1、WesternBlotting虞峰09.6.5一、试剂配制1.基础试剂10%SDS10gSDS加双蒸水溶解，定容至100mL，室温保存1.0mol/LTris-HCl（pH6.8）12.12gTris，用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水至100mL，灭菌后4℃保存1.0mol/LTris-HCl（pH7.5）12.12gTris，加双蒸水至80-90mL,用浓HCl调pH至7.5，加双蒸水至100mL，灭菌后4℃保存1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)18.16gTris,加双蒸水至80-90mL，用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水水至100

2、mL，灭菌后4℃保存0.25mol/LEDTA(pH8.0)9.31gEDTA，加80-90mL双蒸水溶解，,用固体NaOH调pH至8.0，定容至100mL30%Acr-Bismixture29gAccylamide,1gBis-acrtamide,加双蒸水溶解，定容至100mL，4℃避光冷藏10%AP0.6g过硫酸铵，加双蒸水溶解，定容至6mL，分装160μL/管，-20℃冷冻保存2.BuffersLysisbuffer1mol/LTrisHCl(pH7.5)5mL(50mmol/L)0.1mol/LEDTA5mL(5mmol/L)TritonX-1

3、001mL(1%V/V)NaCl0.8775gAddDDwaterUpto100mL6XLoadingBuffer配法：不含DTT的LoadingBufferTirsHCl(pH8.0)25mL甘油100mL10%SDS80mL溴酚蓝0.080g取10mL不含DTT的LoadingBuffer,加入0.540gDTT，溶解后分装，保存在-20℃10XRunningBufferTris36.2g甘氨酸144gSDS10g加双蒸水至1L5/510XTBSTris24.2gNaCl80g加双蒸水至1LTBST10xTBS100mLTween-201mL加双蒸

4、水至900mL，调pH=7.4,加双蒸水定容至1L1XTransBuffer（半干转膜用）Tris-base5.82g甘氨酸Glycine2.93gSDS0.375g甲醇200mL加双蒸水至1L也可配制时不加甲醇,临用时再添加.如果配制的是含有甲醇的溶液，必须用密封容器盛装，以免甲醇挥发10XTransBuffer（湿法转膜用）甘氨酸144gTris33.3g加双蒸水定容至1L1XTransBuffer（湿法转膜用）用双蒸水把10X的TransBuffer（湿法转膜用）稀释到1X的浓度。置于0度或4度冰箱备用。5/53.Gels分离胶10mL6%8%8

5、%10%12%H2O5.33.454.64.03.330%Acr-Bis2.01.952.73.34.01.5mol/LTris-HCl(pH8.8)2.51.952.52.52.510%SDS0.10.0750.10.10.110%过硫酸铵0.10.0750.10.10.1TEMED0.0080.00450.0060.0060.006浓缩胶3mL5%H2O2.130%AcrBismix0.51.0mol/LTris-HCl（pH6.8）0.3810%SDS0.0310%过硫酸铵0.03TEMED0.003*****以上单位都是mL*****可分离的目

6、标蛋白分子量(kD)范围凝胶浓度4-2020%12-4515%10-7012.5%15-10010%25-2008%常用内参分子量(kD)β-actin43GAPDH30-40(43)Tubulin55实验室的电泳槽浓缩胶电压/V分离胶电压/VHoeffer69.6130.5BioRed58.4109.5蛋白提取A.贴壁细胞1.用3mLPBS洗一下细胞2.倒干PBS（尽量干），加入100μLLysisBuffer（每106细胞约60μL）。六孔板则每孔75μL3.冰上放置30-45分钟4.4℃12000g，5min，取上清，注意不要吸到沉淀5.应当在2

7、小时内用蛋白定量分析试剂盒测定蛋白含量，6.按测出的浓度，取100-500μg,用Lysisbuffer稀释，按比例加入Loading5/5Buffer后沸水浴3min7.保存在-20℃B.组织1.剪取适量组织，称重，按每1g组织加入4mLLysisBuffer和50μLCocktail蛋白酶抑制剂2.加液氮，在研钵中研碎，或是用移液枪打碎3.冰上放置30-45min4.4℃12000g，2min，取上清，注意不要吸到沉淀5.保存在-70℃（-20℃短期保存）6.用蛋白定量分析试剂盒测定蛋白含量，7.按测出的浓度，取100-200μg,用Lysisbu

8、ffer稀释，按比例加入LoadingBuffer后沸水浴5min8.保存在-20℃制胶1.选