一种符合gmp的测定抗体浓度分析的快速开发

《一种符合gmp的测定抗体浓度分析的快速开发》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、GEHealthcare应用指南38Biacore系统一种符合GMP的测定抗体浓度分析的快速开发•分析方法性能的轻松、快速验证•分析方法符合目前的ICH指导原则简介对于由重组或杂交瘤技术生产的蛋白，制造规范要求在整个生产过程中须利用验证的分析方法来监测蛋白的浓度。在此，我们描述了一种经验证的分析方法的建立过程，此方法能测图1.来自同一个供应商的16批蛋白A在认证的传感器芯片CM5上的固定收集样品、工艺对照及终产品中抗EpCAMIgG1抗体的浓度定水平。利用10μg/ml蛋白A以5μl/分钟的流速注入7分钟，平均固定（Naundorf

2、等，2002），此抗体是单克隆、完全人源的，用水平为1970±137RU（CV7.0%）。于前列腺癌的治疗。经过三个月的条件优化，我们开发出了准确可靠的分析方法。蛋白A固定条件的优化蛋白A固定在质控级传感器芯片CM5上，以便测定不同批分析验证：初步条件次间固定水平的一致性。16批蛋白A制备成10μg/ml的浓尽管目前还没有验证结合数据方面的明确指导原则，但FDA度，并以5μl/分钟的流速注入传感器芯片，持续时间7分的文件《工业生物分析方法验证指南和工业指南：分析步骤钟，产生的固定水平在1500和2500RU之间（图1）。在和方法验证

3、化学，制造和控制文件》为结合分析的设计提供这些条件下不同批次的蛋白A的固定水平无显着差异。推了普遍接受的指导原则。个别QA部门必须遵守关于分析验荐建立常规程序，以便在进一步分析优化之前实现相似水证的现有ICH指导原则，直到共识建立。平的蛋白A固定。一旦决定了分析的基本设计，分析运行的精确条件必须根据经验确定。在此，根据上述的FDA指导原则建立分析，其中致谢一开始固定蛋白A，作为IgG特异的结合分子，然后在传感我们非常感谢来自慕尼黑MicrometAG的BirgitVetter、器芯片CM5上捕获人源化单克隆抗体。固定、表面再生和传S

4、usanneSchade、ThomasUrbig博士及FrankHanakam感器储存都经过研究，并根据这些数据确定最后分析的最佳博士为本应用指南提供了实验数据。条件。所有实验都是利用认证的传感器芯片CM5和一台Biacore™C系统开展的。通过”EpitopeFocusedSelection”技术产生改造的随后让一个浓度范围的单克隆抗体MT201流经每个流动芯片储存条件的优化槽，并测定结合水平。利用在上述条件下固定的蛋白A实MT201与捕获分子结合之后，我们比较了储存在室温下空气中的芯片与储存在含有叠氮钠的HBS-EP缓冲液中的芯

5、片的表现了MT201的最佳结合。将固定的蛋白A提高到超过此水面稳定性（BiacoreAB，通用电气医疗集团下属公司，瑞典）。平，未观察到MT201的进一步结合（图2）。在一星期后，暴露的传感器芯片的表面活性降低了多达50%，两星期后降低了多达70%。相比之下，储存在HBS-EP缓冲液中的芯片在两个月后仍是完全有活性的（图4）。图2.蛋白A固定水平的优化。MT201与蛋白A的最大结合是利用10μg/ml蛋白A以5μl/分钟的流速注入7分钟而实现的。再生缓冲液的优化我们筛选了20多种缓冲液的各种组合。利用含有10mMNaOH的0.5MN

6、aSCN的单次30秒注入，实现了快速再生。图3.再生缓冲液的优化。含有NaOH的0.5MNaSCN产生了良好的再生（将再生后基线与原始基线比较），几十次运行的变异系数（CV）小于1.5%。最终选择含有NaOH的0.5MNaSCN的理由是出于再生速度以及对化学基团造图4.芯片储存条件的优化。质控级传感器芯片CM5储存在(A)空气中或(B)成最小损害同时能提供可接受的再生效果的考虑。HBS-EP缓冲液中的表面活性影响。分析验证：实验设计稳定性表面活性剂的影响：样品缓冲液中浓度低至0.001%的表面活性剂的存在对信号有着重大的影响。然而，

7、表面活性剂浓度超过0.1%，表面活性剂对信号的影响趋于稳定，对0-10μg/ml的MT201浓度范围内Rmax的影响可忽略不计（图5）。图6.样品缓冲液中的牛血清白蛋白的影响。这些检测显示，样品缓冲液中的BSA与蛋白A竞争性结合，可能遮盖了低浓度MT201与蛋白A结合所产生的信号。分析间的可变性利用四个不同的传感器芯片在不同天内运行了总共26个分析。在所检测的最高浓度的MT201下，分析间的可变性低于10%（图7）。所有实验在7天内开展。图5.稀释缓冲液中表面活性剂的影响。稀释缓冲液中表面活性剂浓度超过0.1%时，分析是可靠的。蛋白

8、A的影响：在MT201的纯化过程中，抗体从蛋白A柱上洗脱。极少量的蛋白A可能污染样品，预计最多50ng/ml蛋白A会从柱中脱落。因此，了解是否有痕量的可溶蛋白A污染是很重要的，它们可能与溶液中的MT201结合，并抑制抗体与传感器芯片上