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1、葡萄膜炎患者外周血单个核细胞TLR9、TLR7mRNA的表达及意义论文丁歆付琳琳苏稚辉刘钢方桂英【摘要】目的观察葡萄膜炎患者外周血单个核细胞(PBMCs)Toll样受体9（TLR9）、Toll样受体7（TLR7）mRNA的表达。方法收集42例葡萄膜炎患者（其中发病与感染相关者12例,与感染无关者30例)和正常对照组（30例)外周血,采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离PBMCs,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PBMCsTLR9、TLR7mRNA表达的相对含量。结果与感染相关葡萄膜炎患者PBMCsTLR9、TLR7mRNA相对含量显著高于与感染无关葡萄膜炎患者和正常对照组(P0.01
2、)，与感染无关葡萄膜炎患者与正常对照组比较TLR9、TLR7mRNA相对含量差异无统计学意义(P0.05)。结论TLR9、TLR97的表达在与感染相关葡萄膜炎患者中显著升高,提示感染因素在葡萄膜炎中的作用可能通过TLR9、TLR7介导。【关键词】葡萄膜炎;外周血单个核细胞;TLR9;TLR7Abstract:ObjectiveToinvestigatetheexpressionofTLR9andTLR7mRNAofperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)inpatients42uveitispatients(12patientsinetherelativ
3、econtentoftheexpressionofTLR9mRNAandTLR7mRNAofthePBMCs.ResultsTherelativecontentofexpressionofTLR9mRNAandTLR7mRNARNAandTLR7mRNAbetRNAandTLR7mRNAinuveitispatientsassociatedightbemediatedbyTLR9andTLR7.Keyononuclearcells;TLR9;TLR7葡萄膜炎是一种T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，多发生于青壮年，易反复发作，治疗棘手，为致盲的主要原因之一。近年的研究表明，Th1型免疫反应在葡
4、萄膜炎中起主导作用［1］。Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)是近年来备受关注的一种细胞表面信号传导跨膜受体，在识别细菌等病原微生物及介导的炎症反应信号通路中有重要作用.freelRNA表达情况。1资料和方法1.1一般资料和分组42例葡萄膜炎患者选自东南大学附属徐州市中心医院眼科门诊及住院患者,经专科检查，诊断明确，包括前葡萄膜炎28例，后葡萄膜炎6例，全葡萄膜炎8例。年龄为9～61岁，平均(27.0±1.6)岁。其中明确发病与感染有关者（与感染相关组）共12例，与感染无关者（与感染无关组）30例。检测前,患者至少1个月内未接受糖皮质激素、免疫抑制剂或具有免疫调
5、节作用的药物治疗。健康志愿者30例为对照组，年龄为8～60岁，平均（29.0±1.8）岁。1.2主要试剂人淋巴细胞分离液、FicollTaqDNA聚合酶(北京鼎国生物技术有限公司),DEPC(Sigma公司),Trizol试剂(Intrivogen公司),ReverTraAce逆转录酶(TOYOBO生物科技公司)。1.3实验方法1.3.1PBMCs的分离抽取研究对象清晨空腹静脉血15ml,Ficoll法分离PBMCs。1.3.2PBMCs总RNA的提取用Trizol-氯仿-异丙醇-乙醇法提取PBMCs总RNA。1.3.3RT-PCR检测TLR9、TLR7表达1.3.3.1逆转录反应合成cD
6、NA取RNA1μg加入oligoT1μl,5×Buffer4μl,.freelmol/LdNTP2μl,RNA酶抑制剂1μl,DEPC水加至20μl。反应条件：42℃20min，99℃5min,4℃5min。1.3.3.2PCR检测TLR9、TLR7mRNA表达相对含量TLR9、TLR7、GAPDH的引物序列设计应用在线引物设计软件Primer3.0，由上海博亚生有限公司合成。具体序列见表1。扩增体系及反应条件:取2μlcDNA,5μl10×PCRBuffer,2μldNTPs,上游、下游引物各2μl、1μlTaq酶,加灭菌双蒸水至总体积50μl;94℃5min预变性,94℃30s,56℃
7、30s,72℃30s,共30个循环,72℃延伸10min。PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,采用凝胶成像分析系统中进行图像分析。以GAPDH为内参照半定量,各样本表达强度=样本灰度值/GAPDH灰度值。表1TLR9、TLR7和GAPDH引物序列（略）1.4统计学处理采用SPSS11.5软件进行统计学处理，所有计量资料均以±s表示。各组间数据比较采用方差分析（one-RNA的平均表达水平明显高于与感染无关葡萄膜
