植物生理生化测定

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1、2.1.8转基因植株在盐胁迫下的超氧化物歧化酶(SOD)活性测定将转基因植株与非转基因对照植株继代于含有0.5%NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为27±1℃，每天13h、3000lux光照。胁迫培养4w后，取其叶片测定其SOD活性，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。2.1.8.1主要试剂及配方（1）0.1mol/lpH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液A液（0.1mol/lNa2HPO4溶液）：称取Na2HPO4·12H2O7.163g，用少量蒸馏水溶解后定容至200ml，4℃冰箱中保存备用；B液（0.1mol/lNaH2PO4溶液）：称取NaH

2、2PO4·2H2O0.780g，用少量蒸馏水溶解后定容至50ml，4℃冰箱中保存备用；取上述A液183ml与B液17ml充分混匀后即为0.1mol/lpH7.8的磷酸钠缓冲液，4℃冰箱中保存备用。（2）0.026mol/l甲硫氨酸（Met）磷酸钠缓冲液称取甲硫氨酸（C5H11NO2S）0.388g，用少量0.1mol/lpH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，再用相同磷酸钠缓冲液定容至100ml，现用现配，4℃冰箱中保存可用1～2d。（3）7.5×10-4mol/lNBT溶液称取NBT（C40H30Cl2N10O6）0.153g，用少量蒸馏水溶解后，定容至250ml，现用现配，4℃冰箱中保存可用2～

3、3d。（4）含1.0μmol/lEDTA的20μmol/l核黄素溶液A液：称取EDTA0.003g，用少量蒸馏水溶解；B液：称取核黄素0.075g，用少量蒸馏水溶解；C液：合并A液和B液，定容至100ml，此溶液即为含0.1mmol/lEDTA的2mmol/l核黄素溶液，避光保存（可用黑纸将装有该液的棕色瓶包好），4℃冰箱中可保存8～10d，当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0μmol/lEDTA的20μmol/l核黄素溶液。（5）含2%PVP的0.05mol/lpH7.8磷酸钠缓冲液取0.1mol/lpH7.8的磷酸钠缓冲液50ml，加入2gPVP（聚乙烯吡咯烷酮），充分溶

4、解后移入100ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀，4℃冰箱中保存备用。2.1.8.2提取及测定方法（1）称取1.0g样品叶片于预冷的研钵中，加入4ml预冷的提取介质（含2%PVP的0.05mol/lpH7.8磷酸钠缓冲液），冰浴研磨匀浆，转入10ml离心管，并用提取介质定容至5ml；（2）4℃10000rpm离心10min，取上清即为酶液提取样品；（3）取透明度好的10ml离心管，每个株系3次重复，按照下表加入试剂：试剂用量（ml）0.05mol/l磷酸缓冲液（2%PVP）0.8750.026mol/lMet缓冲液1.5750μmol/lNBT0.31μmol/lEDTA及20μmol

5、/l核黄素0.3酶提取液（对照管以磷酸缓冲液代替）0.025总体积3.0（4）设3个对照（CK1、CK2、CK3），将CK1包上铝箔避光，与其它样品管（包括CK2和CK3）同时置于4500lux日光灯下反应25min，反应温度28℃；（5）SOD活性测定与计算：至反应结束，立即用黑布遮蔽以终止反应。以遮光的对照管CK1作为空白调零，在560nm波长下测定各管的吸光度，CK2和CK3的平均值作为对照，按下例公式计算SOD活性（SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位）：SOD活性（U/g）=（OD0-OD560）×VT／（OD0×0.5×FW×V1）OD0——光照对照管的光吸

6、收值；OD560——样品管的光吸收值；VT——样液总体积（ml）；V1——测定时样品用量（ml）；FW——样品鲜重（g）。2.1.9转基因植株在盐胁迫下的丙二醛(MDA)含量测定将转基因植株与对照植株继代于含有0.5%NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为27±1℃，每天13h、3000lux光照。胁迫培养4w后，取整株测定其丙二醛含量，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。2.1.9.1主要试剂及配方（1）5%三氯乙酸（TCA）：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，再定容至100ml；（2）0.5%硫代巴比妥酸（TBA）：称取0.5g硫代巴比妥酸，用5%TCA定容至1

7、00ml。2.1.9.2提取及测定方法（1）称取1.0g材料，加入10ml5%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂，研磨至匀浆；（2）3000rpm离心10min，取上清即为丙二醛提取液；（3）取1.5ml上述提取液（对照管取1.5ml5%TCA），加入2.5ml0.5%TBA，混匀后于沸水浴中反应15min，迅速冷却；（4）1800g离心10min；（5）取上清液测定532和600nm波长处的吸光度，以蒸馏水调零