人参皂苷rg1对帕金森病模型小鼠室管膜下区神经干细胞的作用论文

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1、人参皂苷Rg1对帕金森病模型小鼠室管膜下区神经干细胞的作用论文杨赣军张建平李庆耀【摘要】目的：探讨人参皂苷Rg1促进帕金森病模型小鼠原位神经干细胞增殖分化的作用。方法:C57BL/6小鼠随机分成正常组、模型组和人参皂苷Rg1治疗组。采用MPTP腹腔注射建立帕金森病小鼠模型，利用免疫组化单标和双标技术观察人参皂苷Rg1对小鼠侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖分化的影响。结果：人参皂苷Rg1治疗5d，侧脑室室管膜下区的5溴脱氧尿苷(BrdU)、神经上皮干细胞蛋白(Nestin)阳性细胞较模型组明显增多，并可见大量从背外侧

2、角沿胼胝体排列的BrdU、Nestin阳性细胞；人参皂苷Rg1治疗20d，BrdU/Nestin双标细胞的数量较模型组明显增多。结论：人参皂苷Rg1可促进帕金森病模型小鼠脑内神经干细胞的增殖和迁移。【关键词】人参皂苷；帕金森病；神经干细胞；室管膜下区帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是一种常见的中老年神经系统变性疾病，其标志性病理变化为中脑黑质多巴胺能神经元的缺失1。近年来随着神经干细胞(Neuralstemcells,NSCs)研究的深入，利用内源性神经干细胞定向增殖、分化为多巴胺能神经元已成

3、为治疗帕金森病研究的热点。研究发现人参皂苷Rg1(GinsenosideRg1,Rg1)对MPTP诱导PD鼠黑质神经元凋亡有阻断作用，对帕金森病小鼠SNDA能神经元具有明显的保护作用2；在体内人参皂苷Rg1能否刺激帕金森病模型动物脑原位NSCs的增殖及分化鲜见报道。本研究采用1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶(1ethyl,4phenyl1,2,3,6tetrahydropyridine,MPTP)制作小鼠帕金森病模型.freelalventricularzone,SVZ)NSCs的增殖变化以及人参皂苷

4、Rg1的干预作用，为中药防治PD提供更多的实验依据。1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物选用健康雄性C57BL/6小鼠，体重(17±5)g，购自北京维通利华公司动物实验中心。许可证号：SXK京(2004-2006)。1.1.2实验试剂MPTP购自美国Sigma公司，批号：095K1166；人参皂苷Rg1(批号为07032-9812，纯度＞98%)购自昆明制药厂；兔抗小鼠神经上皮干细胞蛋白(Neuroepithelialstemprotin,.freelodeoxyuridine,BrdU)抗体和蛋白酶K均

5、购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化ABC试剂盒、碱磷酶标记链亲合素、碱磷酶底物NBT/BCIP显色浓缩液、DAB试剂盒、磷酸缓冲液(PBS)和枸橼酸缓冲液均购自北京中杉生物技术有限公司。1.1.3实验仪器AE160电子天平购自瑞士METTLER公司；FS/FAS5030石蜡切片机购自德国LETIZ公司；PPTP30mg·kg-1，连续5d。1.2.2分组及处理动物随机分为正常组6只，不作任何处理；模型组12只，造模后不作任何处理；人参皂苷Rg1治疗组12只，从造模第1天开始每天腹腔注射人参皂苷Rg1注射液

6、70mg·kg-1。各组动物的存活期分别是开始造模后的5d和20d。1.2.3取材及处理用10%水合氯醛按0.04mg·kg-1体重对小鼠腹腔麻醉，经左心室升主动脉灌流固定后，取脑，后固定6h，脑经脱水、透明、石蜡包埋，做冠状切片，片厚6μm，常温保存备用。1.2.4免疫组化法(ABC法)常规组织切片脱蜡至水后加新配制1%H2O2甲醇溶液处理20min；0.01M枸橼酸缓冲液(pH6.0)92℃热修复10min，自然冷却至室温；胃蛋白酶K消化(37℃)20min；以上各步之间都采用0.01MPBS洗涤5min×3次

7、。再滴加正常山羊血清工作液，37℃，20min；吸干血清，分别加入一抗小鼠抗PA抗体(1∶50)，兔抗小鼠Nestin抗体(1∶200)，4℃，48h～72h；滴加二抗37℃，2h；滴加三抗37℃，2h；滴加显色剂DAB底物溶液显色，显色时间10min～30min；在滴加一抗至三抗后都采用0.01MPBS洗涤5min×3次。切片双蒸水冲洗，酒精梯度脱水、二甲苯透明、光学树脂封片；阴性对照切片不加一抗，其他处理同上。光镜观察切片，细胞内棕色颗粒为阳性颗粒。1.2.5BrdU/Nestin免疫双标方法首先按常规免疫组织

8、化学ABC法显示核抗体BrdU，显色液为碱性磷酸酶NBT/BCIP显色浓缩液，阳性胞核为蓝色；再按ABC法显示Nestin的表达，底物显色剂为DAB，阳性胞浆为棕色颗粒。光镜观察切片，胞核为蓝色颗粒和胞浆为棕色颗粒的细胞为阳性双标细胞。1.2.6图像分析每个存活期每只动物选视交叉前冠状切片，采用OlympusBX61显微镜1倍物镜采集图像，分别对前侧脑室下区