snt 2767-2011 国境口岸蚊类携带乙型脑炎病毒反转录聚合酶链式反应检测方法

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７６７—２０１１国境口岸蚊类携带乙型脑炎病毒反转录聚合酶链式反应检测方法犚犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀犳狅狉犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犻狀犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７６７—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津

2、出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、上海之江生物科技有限公司。本标准主要起草人：关淳、郑夔、孙哲平、张霞、高旗利、宋锋林、刘培、贺艳、张海滨、邵俊斌。Ⅰ犛犖／犜２７６７—２０１１国境口岸蚊类携带乙型脑炎病毒反转录聚合酶链式反应检测方法１范围本标准规定了国境口岸蚊类携带的乙型脑炎病毒的检测对象、生物安全要求、检测方法、结果报告及处置。本标准适用于对口岸蚊类携带的乙型脑炎病毒的检测及报告。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引

3、用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求３术语与定义下列术语和定义适用于本文件。３．１乙型脑炎病毒犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊乙型脑类的病原体，为黄病毒属，具有包膜的单正链ＲＮＡ病毒。乙型脑炎病毒颗粒呈球形，壳体为２０面对称体，内为含ＲＮＡ的核心，包以含脂蛋白的封套，外面还有含糖蛋白的表面突出物，其表面突出物具有血凝活性。４检测对象国境口岸蚊类中能携带乙型脑炎病毒的成蚊及其幼蚊，如：白纹伊蚊、日本伊蚊及东方伊蚊等伊蚊，三带喙库蚊、二带喙库蚊、魏仙库蚊、伪杂鳞库蚊、困扰库蚊、致倦库蚊、淡色

4、库蚊及白雪库蚊等库蚊，中华按蚊等按蚊。５实验室生物安全要求５．１实验室生物安全要求见ＧＢ１９４８９。５．２下列操作应在生物安全２级（ＢＳＬ２）实验室中进行：———可能产生含病毒气溶胶的样品处理；———收集或浓缩病毒；———病毒ＲＮＡ提取和扩增；———离心管和离心机转头的封闭和开启。１犛犖／犜２７６７—２０１１６反转录聚合酶链反应检测６．１主要器材和设备６．１．１ＰＣＲ仪。６．１．２电泳仪。６．１．３紫外凝胶成像仪。６．１．４台式低温离心机：１００００犵。６．１．５组织研磨机或电动匀浆机。６．１．６低温冰箱：－８０℃。６．２试剂６．２．１样品制备及ＲＮＡ提

5、取试剂：青霉素、链霉素、Ｈａｎｋ’ｓ液、裂解液、三氯甲烷、无ＲＮａｓｅ超纯水、７５％乙醇、异丙醇（未开封新品）、ＤＥＰＣ。６．２．２ＲＴＰＣＲ反应试剂：上游引物Ｐ１（５’ＣＡＴＴＣＣＡＡＧＣＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＣＣ３’），下游引物Ｐ２（５’ＧＡＣＧＴＣＣＡＡＴＧＴＴＧＧＴＴＴＧＴＣＧ３’），逆转录酶ＡＭＶ（１０Ｕ／μＬ），犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／），ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），氯化镁溶液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ），ＲＮａｓｅ抑制剂，１０×ＰＣＲ缓冲液，阳性对照μＬ（乙型脑炎病毒弱毒疫苗，病毒效价不低于１０６ＰＦＵ，用Ｈａｎｋ’ｓ液复溶成２．０

6、ｍＬ液体，取２０μＬ加入１８０μＬＨａｎｋ’ｓ液混匀制成取阳性对照），阴性对照，琼脂糖（分析纯），溴化乙锭或其他有效染料，分子量标记，５×ＴＢＥ电泳缓冲液，６×加样缓冲液。６．３操作方法６．３．１样品采集将采集的蚊虫标本冷冻致死，分类、分组（标本数量较多时可以３０只～５０只为一组），置－８０℃低温冰箱或液氮中保存。６．３．２样品制备将待检蚊虫标本每组分别用含青霉素（１０００Ｕ／ｍＬ）、链霉素（１０００Ｕ／ｍＬ）的无菌生理盐水清洗三次，每组蚊样加入２．０ｍＬＨａｎｋ’ｓ液，在组织研磨器中研磨或电动匀浆机中匀浆２０ｓ～３０ｓ，使样品匀浆成糊状，１０００犵离心３

7、ｍｉｎ，取上清液作为样品。６．３．３犚犖犃抽提６．３．３．１为防止ＲＮＡ降解，所用实验用具及溶液应无ＲＮＡ酶，操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换，以避免皮肤表面的ＲＮＡ酶污染用具或带入溶液。６．３．３．２取６．３．２中样品上清液２００μＬ加入１．５ｍＬ无ＲＮａｓｅ离心管中，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ或其他等效裂解液，剧烈振荡３０ｓ，室温放置５ｍｉｎ。同时将阳性对照、阴性对照同步进行ＲＮＡ提取。６．３．３．３加入０．２ｍＬ三氯甲烷，用力振荡至乳剂状，室温静置５ｍｉｎ，使水相和有机相分开，水相无色在上，有机相红色在下。４℃１００００犵离心１５

8、ｍｉｎ，使水相和有机相彻底分开，吸出水相至新的１．５ｍＬ无ＲＮａｓ