snt 1152-2011 鲤春病毒血症检疫技术规范

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１５２—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１１５２—２００２鲤春病毒血症检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狊狆狉犻狀犵狏犻狉犪犲犿犻犪狅犳犮犪狉狆２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准鲤春病毒血症检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１１５２—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１

2、２３０１／１６印张１字数２５千字２０１１年７月第一版２０１１年７月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２１２９定价１８．００元犛犖／犜１１５２—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１１５２—２００２《鲤春病毒血症病毒逆转录—聚合酶链式反应检测方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ１１５２—２００２相比，主要技术变化如下：———增加了荧光ＲＴＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ方法。参考了ＯＩＥ《水生动物诊断实验手册》第２．３．８章中推荐的鲤春病毒血症病毒的细胞培养分离、ＲＴＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ方法。请注意本文件的某些内容可

3、能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张利峰、高隆英、史秀杰、王姝、段向英、张鹤晓、唐连飞、雷质文、江育林。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１５２—２００２。Ⅰ犛犖／犜１１５２—２０１１鲤春病毒血症检疫技术规范１范围本标准规定了鲤春病毒血症（ＳＶＣ）的细胞培养分离病毒、ＲＴＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ和实

4、时荧光ＲＴＰＣＲ检测技术。本标准适用于鲤春病毒血症的流行病学调查、诊断、检疫和监测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＳＮ／Ｔ１１９３基因检验实验室技术要求水生动物疾病诊断手册（ＯＩＥ，２００９年）３犛犞犆病毒的分离和鉴定３．１诊断原则本标准中的细胞分离病毒的方法可以用于从有临床症状的病鱼中分离病毒，也可以从无临床症状的病毒携带鱼中分离病毒；ＥＬＩＳＡ方法、ＲＴＰＣＴ方法

5、和实时荧光ＲＴＰＣＴ方法则可以用于鉴定从细胞中分离到的病毒，或者有临床症状的病鱼组织中的病毒。其ＳＶＣ确诊病例的评价标准见第４章。３．２采样３．２．１采样部位鱼应是活的送到实验室。如是体长≤４ｃｍ的鱼苗取整条鱼，但如有卵黄囊则需除去；体长４ｃｍ～６ｃｍ的鱼苗取包括肾脏和脑在内的所有内脏；体长≥６ｃｍ的鱼则取肝、脑、脾、肾。成熟雌鱼还需在产卵期采集一次卵巢液。３．２．２有临床症状的鱼挑选１０条有代表性的临床症状的病鱼或者濒死鱼。３．２．３无临床症状的鱼随机采集不少于１５０尾鱼样品。３．２．４用于宣布犛犞犆无病区的监测时的采样技术要求３．２．４．１为获取鱼

6、群健康状态的采样要求在２年内每年对该养殖场检查两次。检查时间应选在一年中最易观察到临床症状并能分离到病原体的温度和季节。每次采集１５０尾鱼，或者在有怀卵鱼的情况下，两次检查中要有一次在指定的养殖单１犛犖／犜１１５２—２０１１位的亲鱼中取１５０份卵巢液样品。３．２．４．２为保持鱼群健康状态的采样要求一旦生产单位包括池塘的鱼及其设施经实验室检测两年，无ＳＶＣＶ，也无任何可疑临床症状之后，每年还应继续检疫两次。每次采集的样品可以减少到６０尾，并尽可能包括怀卵鱼。但在检疫中发现有濒死鱼时应采样做进一步的实验室检查。３．３样品的合并对于病毒分离，将三到五尾鱼的组织

7、脏器混合为一份样品。对于ＲＴＰＣＲ、实时荧光ＲＴＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ检测，如果是病鱼组织，应每尾病鱼测定。３．４设备和材料３．４．１设备倒置显微镜、低温培养箱、－２０℃普通冰箱、－８０℃超低温冰箱、组织研磨器、冷冻离心机、生物安全柜、ＰＣＲ仪、实时荧光ＰＣＲ仪、电泳仪、微波炉、微量移液器、凝胶成像仪或紫外观察灯、高压灭菌锅、水浴锅、制冰机、磁力搅拌器、培养液过滤器、酶标仪和洗板机。３．４．２材料３．４．２．１水：应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。用于ＰＣＲ（包括核酸抽提）时所用的水要用ＤＥＰＣ处理以除掉ＲＮＡ酶。３．４．２．２ＳＶＣ病毒标准株。３．

8、４．２．３鲤鱼上皮瘤细胞（ＥＰＣ）或草鱼性腺细胞（ＣＯ）或胖头鱼肌肉细胞（ＦＨＭ