snt 2717-2010 马传染性贫血检疫技术规范

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７１７—２０１０马传染性贫血检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犲狇狌犻狀犲犻狀犳犲犮狋犻狅狌狊犪狀犲犿犻犪２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７１７—２０１０前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：朱来华、梁成珠、郑小龙、邓明俊、肖西志、岳志芹、辛学谦、孙涛、王

2、群。Ⅰ犛犖／犜２７１７—２０１０马传染性贫血检疫技术规范１范围本标准规定了马传染性贫血的临床诊断、病毒分离鉴定、酶联免疫吸附试验、琼脂凝胶免疫扩散试验等检疫技术。本标准适用于马属动物马传染性贫血的检疫和诊断。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１７４９４马传染性贫血病间接ＥＬＩＳＡ诊断技术３临床诊断３．１临床特征马传染性贫血（ＥＩＡ

3、）特征性症状及病理变化表现为高热稽留（３９℃以上）、或间歇热（持续高热３ｄ～５ｄ，经３ｄ～１５ｄ常温间歇期又复发）、或出现温差倒转现象；在舌底、口腔、鼻腔、阴道粘膜及眼结膜等处，常见鲜红色至暗红色出血点（斑）等；贫血、黄疸、心脏衰弱、浮肿和消瘦等特征性症状及病理变化。３．２判定根据特征性症状及病理变化（见３．１）可做出初步诊断。进一步确诊应采集病料或血清样品进行实验室检查。４实验室检测方法４．１病毒分离鉴定４．１．１试验材料细胞培养瓶（８０ｍＬ），赛氏液、细胞生长液、阿氏液、驴外周血白细胞制备见附录Ａ。实验室用水按照

4、ＧＢ／Ｔ６６８２规定。４．１．２病料采集与处理无菌采集被检马属动物的抗凝血，在室温放置３０ｍｉｎ～４０ｍｉｎ，收集中间淡黄色的白细胞层，每管分装５００，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，白细胞沉淀－８０℃保存备用。μＬ４．１．３细胞培养按附录Ａ制备驴外周血白细胞，加入细胞生长液后培养１ｄ～２ｄ后，如细胞已贴壁并伸出突起，即可接种病料。１犛犖／犜２７１７—２０１０４．１．４病料接种在倾弃细胞培养液后，接种病料５００，３７℃吸附１ｈ～２ｈ后吸弃接种的病料，换入新鲜的细胞μＬ生长液。４．１．５培养接种病料的细胞在

5、３７℃含５％二氧化碳培养箱培养７ｄ～８ｄ，每天在倒置显微镜下观察。初代分离培养通常难以出现细胞病变，一般需盲传２代～３代。４．１．６判定标准如盲传２代～３代，仍无细胞病变，则判定为阴性。如出现以细胞变圆、破碎、脱落为特征的细胞病变，则初步判定为阳性。病毒鉴定需要以１∶１００浓缩的阳性培养物为抗原进行酶联免疫吸附试验（见４．２）或琼脂凝胶免疫扩散试验（见４．３）进行确诊。４．２酶联免疫吸附试验（犈犔犐犛犃）４．２．１血清抗体检测按常规方法静脉采集马属动物血液并分离血清，２℃～８℃冷藏保存备用。ＥＬＩＳＡ按照ＧＢ／Ｔ１７

6、４９４操作。４．２．２病毒分离物鉴定按４．１制备病毒培养物，以原体积１∶１００浓缩阳性培养物，并以浓缩阳性培养物为包被抗原，ＥＬＩＳＡ按照ＧＢ／Ｔ１７４９４操作。４．３琼脂凝胶免疫扩散试验（犃犌犐犇）４．３．１器材微量移液器、平皿、三角瓶、薄壁型金属打孔器（外周直径５ｍｍ）。４．３．２试剂ＰＢＳ按附录Ｂ．１配制。实验室用水按照ＧＢ／Ｔ６６８２规定。标准抗原和标准阳性血清、阴性血清。使用前，按说明书规定稀释至工作浓度。４．３．３样品制备４．３．３．１血清：按４．２．１制备血清。４．３．３．２病原制备：按４．２．２制备病

7、原。４．３．４琼脂板的制备取优质琼脂１．０ｇ，可直接放入含有万分之一硫柳汞的１００ｍＬ的ＰＢＳ液中，用热水浴融化混匀，倒入直径９０ｍｍ的平皿１５ｍＬ～１８ｍＬ，厚度约２．５ｍｍ左右，冷却备用。４．３．５打孔反应孔现用现打并封底。在坐标纸上画好七孔型图案。把坐标纸放在带有琼脂板的平皿或玻璃板下面，照图案在固定位置上用金属管打孔，将切下的琼脂板取出，勿使琼脂膜与玻璃面离动。外周孔径２犛犖／犜２７１７—２０１０为５ｍｍ，中央孔径为５ｍｍ，孔间距３ｍｍ，如图１所示。打孔完毕，在琼脂板上端写上日期及编号等。图１七孔型４．３．６

8、滴加样品４．３．６．１血清抗体检测在图１（七孔型）的中央孔加抗原，２、５孔加检验用标准阳性血清，其余１、３、４、６孔加入受检血清。４．３．６．２病毒分离物鉴定在图１（七孔型）的中央孔加阳性，２、５孔加检验用标准阳性抗原，其余１、３、４、６孔加入受检病毒分离物。４．３．７温育平皿加盖，待孔中液体吸干后，将平皿倒置，以防水分蒸发；琼脂板则放入铺有数