胰岛素的合成、分泌和作用机制

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胰岛素的合成、分泌和作用机制    胰岛素是由胰岛B细胞所分泌的，具有重要代谢调节作用的肽类激素。旱在19世纪末期,vonMering和Minkowski即指出，胰腺在抗糖尿病的作用中起重要作用。1909年和1917年，deMayer和SirEdwardSharpey—Schaffer分别命名这种胰岛内调节血糖水平的激素为“胰岛素”。直到20世纪20年代初期，加拿大人Banting、Best和Collip才真正分离出牛胰岛素，并稍后作为特效药应用于糖尿病患者。随后，结晶胰岛素的获得，氨基酸顺序的阐明，具生物活性的胰岛素的合成，胰岛素检测方法的建立，对胰岛素生物合成途径及分泌机制的认识，胰岛素受体的发现，均成为人类对胰岛素本身及相关疾病认识的里程碑。随着医学及相关科学的发展，特别是近年来分子生物学方法的广泛应用，人们对这个领域的认识突飞猛进，也推动了糖尿病学的迅速发展。一、胰岛素的提取、纯化及结构特征   1．胰岛素的提取、纯化和检测早期，胰岛素是以乙醇或酸性乙醇溶液来抽提的，以这种方法抽提可使胰岛素从组织中溶解出来，并灭活蛋白酶。这种方法仍为现代提取方法的基础。在有机溶剂提取脂肪后．含胰岛素的酸性乙醇的抽提物可经盐析及等电点沉淀等分离，进一步作凝胶过滤，离子交换，高效液相色谱等纯化。以前曾一度认为以锌结晶方法可有助于胰岛素的纯化，现认为反复结晶仍不能去除胰岛中的其他成分，如胰升糖素、胰岛素原、胰岛素样类似物及部分降解的胰岛素片段，而且部分动物的胰岛素不能与锌结合或产生结晶。基因重组胰岛素的生物合成技术可得到不含其他激素的较纯净的胰岛素，但仍常含有其他来自宿主细菌或真菌的蛋白质污染，经凝胶过滤和离子亲和层析后，可得到纯度高于99％的胰岛素。这种胰岛素对人的抗原性远小于来自动物的结晶胰岛素，不易产生抗体，更有利于糖尿病病情的控制。   血清胰岛素测定可用放射免疫法等，但在精确度和敏感性方面仍有一定的局限性。用聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱可鉴定胰岛素的量及纯度，并区分开胰岛素和胰岛素原。各种免疫或生化的方法只能测定出样品的胰岛素的免疫纯度及含量，即使较纯的胰岛素仍需进行生物活性的评价，可在体外用培养的脂肪细胞、肝细胞来测定其在葡萄糖氧化，脂肪合成，葡萄糖转运及蛋白质合成等作用，亦可以用某些细胞膜抽提液来测定其与受体的结合及生物效应。另一些实验室用体内降血糖试验来评估胰岛素的效价。   2．胰岛素结构自1955年Sanger等首先阐明了完整的牛胰岛素一级结构以来，已经鉴定了70余种脊椎类动物的胰岛素结构。他们与一些非脊椎类动物的胰岛素相关肽，如蜗牛的生长刺激素，蚕的胰岛素样脑肽等有着一定的同源性，均为胰岛素基因超家族的成员。脊椎类动物的胰岛素有着共同的结构特征：包括链内和链间二硫键的位置，A链的C端和N端氨基酸残基，以及B链C端的亲水基团。这些结构对保持胰岛素的二级结构和三级结构，维持其与受体结合必须的空间构像非常重要。去除或替换这些保守区域的氨基酸残基将严重影响胰岛素的生物学活性，如去除A链21位羧基端的门冬酰胺，可使其生物活性几乎全部丧失；若以精氨酸替代可使活性丧失近一半。   非保守区域的氨基酸残基对生物活性的影响并无重要作用，因此一种动物的胰岛素，可在另一种动物体内引起生物效应，如猪胰岛素被利用来作糖尿病患者的治疗。但这些位置的氨基酸往往可对其免疫原性产生影响。脊椎动物胰岛素的一级结构均由A、B两条链构成，两链间由2个二硫键(-s-s-)相连，A链还有1个链内二硫键。人胰岛素的A链由21个氨基酸残基构成，B链由30个氨基酸残基构成。 尽管一些非保守区域的氨基酸残基，在不同的种属相差较大，如人和八目鳗的胰岛素的氨基酸残基有40％不同，但X线晶体衍射和磁共振研究均提示脊椎动物的胰岛素晶体的立体构型非常相似，提示胰岛素分子内的保守区域，在维持其结构特征方面起着重要的作用。锌结晶胰岛素的立体结构是由3个胰岛素二聚体围绕2个锌原子构成的轴聚合而成，位于B链第10位的组氨酸残基的咪唑环与锌原子方向一致，依靠B链C端的第24位和26位的氨基酸残基之问的氢链，形成六聚体，最终形成反向平行的片状结构。   早期的研究认为：B链C端的刚性结构与胰岛素和受体的结合有重要作用。但将胰岛素B链29位赖氨酸与A链位的甘氨酸连接起来．其结晶的空间构像与正常胰岛素相仿，但无生物学活性。两者的区别在于B链的C端构像不易改变。最近磁共振的研究也提不B链C端的构像改变对胰岛素与受体的结合有重要影响。二、胰岛素的生物合成与分泌   1.前胰岛素原、胰岛素原及C肽前已述胰岛素是由两条以二硫键相连的A、B肽链所构成•人的胰岛素分子由51个氨基酸残基构成，其前体为86个氨基酸构成的单条肽链，其中，除含A、B链外还含有两者之间的连接肽，称为C肽(connectingpeptide，cpeptide)．这条包含A、B链及C肽的肽链即为胰岛素原。胰岛素原在许多方面与胰岛素有着共同的特征，包括溶解度、等电点，内部二硫键的形成及位置，以及与抗胰岛素抗体反应的能力等，提示胰岛素原与胰岛素的空间构像非常相似，并可形成锌结晶的六聚体，体外研究表明：胰岛素原仅具3％～5％的胰岛素生物活性。说明C肽的存在并不完全掩盖胰岛素原中的与胰岛素受体结合的区域，对胰岛素原之间相互形成二聚体和六聚体也不起阻碍作用。   目前认为：C肽不具有激素样的功能，在不同的脊椎动物种属间差异也较大(图4-2)。但也有报道认为C肽在肌肉的微循环中起一定的作用，目前尚未成定论。C肽在胰岛素的生物合成中，也起一定作用，它可增大合成的肽链的长度，而有助于在粗面内质网的转位，同时在胰岛素空间构型的形成，增强巯基的氧化形成二硫键以及抵抗蛋白酶的酶解作用方面有作用。针对C肽区域所形成的抗原决定簇的单抗在胰岛素原、胰岛素、C肽等方面的研究提供了实用的工具。前胰岛素原为胰岛素原的前体分子。在其一级结构的N端有一条24个氨基酸残基的多肽，称信号肽。信号肽并非前胰岛素原所特有，在动物、植物、细菌等，几乎所有的分泌性蛋白的N端或接近N端，均有这种肽链结构。其作用是通过复杂的分子间作用，使新合成的肽链穿过粗面内质网的质膜，转运到细胞内的内质网膜池。人血浆中并无完整。+的前胰岛素原分子，因在转运的过程中，信号肽即由相应的信号肽酶切除而形成胰岛素原。   2．胰岛素的生物合成和分泌胰岛素基因位于11P15．5，含3个外显子和2个内含子。生物合成先转录成446bp的mRNA，编码前胰岛素原的肽链。然后按此mRNA为模板，翻译合成整个肽链。   首先合成含疏水氨基酸残基的信号肽。新合成的信号肽及mRNA--核糖体复合物与内质网内游离的信号肽识别颗粒(signalrecognitionparticle)桕结合．再被位于粗面内质网膜上的信号肽识别蛋白的受体，也称锚泊蛋白(dockingprotein)所识别，使核糖体附着于膜上，并使信号肽与膜上的信号顺序受体(signsequencereceptor)相互作用，并引导信号肽穿过粗面内质网膜。信号肽识别蛋白具有GTP水解酶活性．使信号肽与质膜上的信号顺序受体结合后即水解而与核糖体复合物分离。信号肽在引导肽链穿过粗面内质刚时或其后数秒内即被信号肽酶切除．肽链继续延伸直至终止信号出现．完成胰岛素原的合成。．   胰岛素原肽链合成完毕后，分子折叠．形成特定构型，由蛋白巯基还原酶催化形成二硫键．并被转移至高尔基器进一步加工。早期，曾认为将胰岛素原酶切转变为腆岛素和C肽的酶．是具有胰蛋白水解酶样活性和羧基肽酶B样活性的酶系来完成，现已弄清是枯草杆菌蛋白酶相关的蛋白原转换酶(subtilisin—relatedproprotein convertase)PC2和PC3参与肽链的断裂，而羧基肽酶H参与胰岛素成熟的进一步加工过程。PC2的编码基因位于染色体20P11．23，其作用在A链的N端起始部位，使肽链断裂。PC。的编码基因位于染色体的5q15～214，其作用在C肽N端起始部位。羧基肽酶H则水解B链C端的两个精氯酸残基，以及C肽C端赖氨酸-精氨酸残基。在某些生理信号如葡萄糖浓度增加，精氨酸刺激等作用于胰岛B细胞时，成熟的分泌颗粒通过胞吐(exocytosis)而释放。同时释放的还有等分子数的C肽和少量的胰岛素原，未完全裂解形式的胰岛素中间产物，以及更少量的细胞的其他分泌产物。三、胰岛素的生理作用   1．胰岛素受体胰岛素是通过其受体发挥生物学作用的。不同细胞的胰岛素受体的数目差异较大，从每个细胞上少于100个到多于200000个．而在肝细胞中更多。胰岛素受体与所有的受体一样，具有特异性、敏感性、可饱和性，可迅速与胰岛素结合而发挥生理功能。胰岛素受体基因，位于19号染色体短臂5，其长度大于150kb，含22个外显子。每个外显子又被较长的内含子分隔。其转录产生的mRNA长度在5．7～9．5kb。成熟的胰岛素受体，分子量为350000-440000的跨膜糖蛋白，由2个分子量为135000的a亚基和两个分子量为95000的ß亚基所组成，以二硫键相连形成ßɑɑß异四聚体。a亚基完全位于细胞膜外，不含穿膜段和细胞内段，两个亚基以二硫键相连，含胰岛素结合位点。ß亚基含有较小的细胞外段以及跨膜段和细胞内段，细胞外段以二硫键与a亚基相连，细胞内段具有酪氨酸蛋白激酶(tyrosineproteinkinase，TPK)活性。   ɑ、ß亚基问的共价结合，为胰岛素受体功能所必需，若破坏ɑ、ß亚基间的二硫键．则亚基的TPK活性丧失。对亚基跨膜段进行氨基酸残基修饰或诱导突变．受体仍可将信号传导入到细胞内。若以erbB-2原癌基因编码的相应长度的蛋白质替换跨膜段，则受体活性丧失，提示跨膜段对信号传导有作用，但少量氨基酸改变对此作用影响不大．推测跨膜段对在胰岛素刺激后，受体的“寡聚化(oligomerigation)”有作用。   现已知，胰岛素受体上6～7个酪氨酸残基，在酪氨酸激酶的激活下，对逐级放大的磷酸化作用的产生起重要作用。主要集中在3个区域，分别为近膜段的Tyr960(右上编号为相应酪氨酸残基在受体中的位置，下同)，其后的Tyrl146、Tyrl150、Tyrl151以及更近肽链C端的Tyrl316、Tyrl322。在Tyr960被去除或由苯丙氨酸取代，受体酪氦酸激酶可激活，但不能进一步使内源性底物磷酸化，推测与信号传导损害及受体内化(inter—nailize)，即向细胞内转移障碍有关。Tyrll46、Tyrll50及Tyrll51的单个或不同组合的突变均可造成TPK活性损害及相应生物作用的丧失。   对8亚基C端的功能各家报道差异较大。有研究认为，去除C端的43个氨基酸残基，对酪氨酸激酶的活性无影响，但对抗原合成的激活作用减弱，而刺激DNA合成能力增强。也有类似的研究认为，对后两者均无影响。   胰岛素受体一些位点如丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化常可降低TPK的活性，引起这些残基磷酸化的因素包括cAMP、巴豆油酯(phorbolester)及胰岛素。其机制尚不清楚，可能参与2型糖尿病的发病。   2．胰岛素的生理作用胰岛素由B细胞分泌后，直接进入门静脉，对碳水化合物、蛋白质、脂类及核酸的代谢起调节作用。胰岛素对碳水化合物代谢的影响，是其最显著的生物学作用。胰岛素通过增加肝脏、肌肉和脂肪摄取葡萄糖，从而增加葡萄糖的利用，该作用主要是通过在葡萄糖转运过程中，增强磷酸化而达到的，并增加葡萄糖摄取后的糖原合成和氧化。另一个作用是抑制葡萄糖的产生，是通过抑制糖原分解和降低糖异生而达到的。其共同后果是使血糖的浓度降低。    对脂类代谢，胰岛素也有重要的影响。它可抑制脂肪组织的脂肪分解，刺激脂肪细胞内游离脂肪酸的重新酯化，从而抑制脂肪酸向脂肪组织以外转移；抑制血浆游离脂肪酸摄取和氧化；激活脂蛋白脂肪酶，增加外周组织对脂蛋白中三酰甘油的清除；还可抑制肝内酮体合成，增加外周酮体的清除和代谢而降低血循环中酮体的浓度。   胰岛素对蛋白质的代谢也有重要影响，它可抑制蛋白质的分解，减少氨基酸氧化，促进氨基酸的转运，增加蛋白质的合成．起正氮平衡作用。胰岛素的另一个生理作用是对生长的影响。胰岛素为一促合成代谢的激素，其对合成代谢的促进作用为生命存在和生长所必须。胰岛素本身也是一个生长促进因子，可与生长介素(somatomedin)，又称胰岛素样生长因子一1(insulin～likegrowthfactor-1，IGF-1)的受体相互作用，促进生长桕关綦因表达而引起细胞增生，并刺激生长介素的产生。   3.胰岛素作用的分子机制胰岛素的上述生理作用中，对糖代谢的调节作用是最快发生的。胰岛素可在数秒至数分钟内抑制肝糖原输出，促进肌肉及脂肪组织掇取和储存葡萄糖，从而使血糖降至正常。胰岛素的中、长期作用，包括调节氢基酸及离子的掇取，蛋白质的合成和降解，基因的转录，细胞的生长和分化。   胰岛素的作用，依顺序可分为三个步骤。第一步为胰岛素在细胞表面的作用，包括胰岛素与其受体结合，激活受体酪氨酸激酶，并引起胰岛索受体底物的磷酸化。第二步为通过一系列蛋白质磷酸化一去磷酸化的过程，引起细胞内与代谢及生长有关的关键酶的激活，涉及的酶包括Raf-1激酶，激活有丝分裂的蛋白激酶(mitogen—activatedproteinki—nase，MAPK)、MAPK激酶(MAPKkinase，MAPKK)及分子量为70000和90000的核糖体S6激酶。第三步为产生信号传导的最终生物学效应，包括葡萄糖转运，糖原、脂质及蛋白质合成酶的激活，DNA合成及一些基因的转录。   胰岛素以高亲和力与其受体结合，结合后引起受体的聚集及内化。通过内化，可使细胞膜表面的受体数目下降，避免过多刺激引起的反应。经内化进入细胞内的受体与溶酶体或高尔基体融合后，激素-受体复合物被酶解。部分未被酶解的受体可通过微管系统重返细胞表面。胰岛素受体属于酶偶联膜受体，本身具有蛋白酪氨酸激酶的活性。胰岛素与受体结合后，激活PTK，先使受体自身磷酸化，后引起细胞内下游物质的酪氨酸磷酸化，或引起其他信号分子与酪氨酸磷酸化的受体非共价结合，再导致进一步的生物学效应。蛋白质-蛋白质相互作用为信息传递的模式，这种作用主要通过SH2(Src-homology2)g-段与自身磷酸化受体或分子中含磷酸酪氨酸片段的亲和结合而发生。   胰岛素受体底物-1(insulinreceptorsubstrate-1，IRS-1)为胰岛素信号传导的主要下游物质，其基因位于染色体2q36—37，成熟的蛋白质分子量约为160000，磷酸化后分子量为180000。在基础状态时，部分丝氨酸及少量苏氨酸残基磷酸化，胰岛素刺激后，酪氨酸及丝氨酸残基的磷酸化明显增加。其分子内部6个含YMXM或YVXM(X为任意氮基酸，Y为酪氨酸，V为缬氨酸，M为蛋氨酸)的特殊磷酸化肽段，可于含SH2片段的肽链结合，这些肽包括磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidyl-inositol-3-kinase，PI-3-kinase)、Grb2、SH—PTP2、nck、fyn等．对PI-3激酶和SH—PTP：起激活作用。   PI-3激酶可催化PI、PI-4-P、PI-4，5-P2的3位上磷酸化，产生PI-3-P、PI-3，4-P2PI-3，4，5-P3。这些磷脂在糖代谢中的确切功能，目前尚不清楚，但胰岛素刺激的葡萄转运及核糖体S。激酶的活化需PI-3激酶的活化。PI-3激酶还可通过胰岛素蛋白质P60／55磷酸化而激活。   SH—PTP：为一磷酸酪氮酸磷酸酶，分子最70000。可激活MAPK而促进糖原合成及有关基因表达，并通过使IRS一1去磷酸化而调节胰岛素的信号传导。胰岛素受体可通过IRS—l或其他途径如Shc使Grb：磷酸化，使之再通过鸟苷转换因子(guaninenucleotideexchangefactor)mSOS及GTP酶激活蛋白(GTPasc-activatingprotein，GAP)PP21ras的活性。P21 ras为分子量21000为小GTP结合蛋白超家族的成员。在多种生长因子的信号细胞生长和分化的作用、P2lras被激活后与Raf一1激酶形成复合物，并使后者激活，通过Raf使MAPKK激活．使之通过MAPK途径影响代谢。   目前胰岛素作用的确切机制尚有许多具体细节有待弄清。除这几个主要途径外，在一些细胞系还发现了多种与胰岛索信号传递相关的蛋白，有待进一步研究。（1）人体是这么产生胰岛素的：第11对染色体短臂上胰岛素基因区DNA向mRNA转录，mRNA从细胞核移向细胞浆的内质网，转译成由105个氨基酸残基构成的前胰岛素原。前胰岛素原经过蛋白水解作用除其前肽，生成86个氨基酸组成的长肽链——胰岛素原（Proinsulin）。胰岛素原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，连接上二硫键，经蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三个精氨酸连接的链，断链生成没有作用的C肽，形成α链和β链的胰岛素，分泌到B细胞外，进入血液循环中。 （2）大肠杆菌没有高尔基体等细胞器，基因工程如何利用大肠杆菌合成胰岛素？《微生物学教程》（周德庆）：1978年美国的2个实验室合作，通过基因工程使E.coli合成了人胰岛素。在实验室中将人胰岛素基因A、B链的人工合成基因分别组合到E.coli的不同质粒上，然后再移至菌体内，着种重组质粒在E.coli细胞内进行正常的复制和表达，从而使带有A、B链基因的工程菌株分别产生人胰岛素A、B链，然后再用人工的方法，在体外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。