肺炎链球菌候选蛋白疫苗clpp的保守性和抗原性论文

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1、肺炎链球菌候选蛋白疫苗ClpP的保守性和抗原性论文李岱容，曹炬，王虹，吴凯峰，尹一兵【摘要】目的:评价酪蛋白裂解酶P(ClpP)作为候选疫苗的保守性和抗原性，分析在不同血清型肺炎链球菌（SPN）中的表达情况.方法:以TIGR4型SPN的ClpP基因序列设计引物，分别以12株不同血清型SPN的基因组DNA为模板，对ClpP基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增、胶回收产物与PMD18克隆载体连接后进行测序.freeloniae，SPN）是引起获得性肺炎、中耳炎、鼻窦炎的主要病原菌.随着多重耐药菌株的不断发现，疫苗

2、在预防和控制SPN感染中的作用越来越重要［1］.SPN根据荚膜可分为90多个血清型，开发对所有血清型SPN都具抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前SPN疫苗的发展方向.研究发现的SPN蛋白质候选疫苗酪蛋白裂解酶P(caseinolyticproteaseP,ClpP）是ATP依赖的丝氨酸蛋白水解酶［2］，其在SPN的生存、致病和入血过程中起着重要的作用［3-4］，针对其靶点的疫苗或抗生素也越来越显示出其潜在的价值.本研究探讨ClpP在不同SPN菌株中的保守性与抗原性，以及在不同血清型SPN中表达情况，旨在为自主开

3、发SPN蛋白疫苗奠定基础.1材料和方法1.1材料1.1.1菌种与质粒12株不同血清型SPN：CMCC(B)31109(serotype1)，CMCC(B)31203(serotype3)，CMCC(B)31446(serotype4)，CMCC(B)31011(serotype5)，CMCC(B)31207(serotype6B)，CMCC(B)31507(serotype7F)，CMCC(B)31216(serotype9V)，CMCC(B)31614(serotype14)，CMCC(B)31687(se

4、rotype18C)，CMCC(B)31693(serotype19F)，CMCC(B)31759(serotype23F)（北京中国医学细菌保藏管理中心），NCTC7466(serotype2，国际通用名为D39)（欧洲国家标准菌种库）；大肠杆菌DH5a和原核表达系统(含pET32a(+)/ClpP重组质粒)E.coliBL21(DE3)(重庆医科大学临床检验诊断学重点实验室)，金黄色葡萄球菌标准菌株(重庆医科大学微生物学教研室)，质粒PMD18T载体试剂盒(日本TaKaRa公司).1.1.2试剂DNA提

5、取试剂盒，凝胶回收试剂盒及日常型质粒DNA快速制备试剂盒(上海华舜公司)；限制性内切酶EcoRI，SacI，高保真LATaq聚合酶，dNTPs，Buffer，MgCl2(大连宝生物技术公司)；丙烯酰胺，双丙烯酰胺，异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)(美国Sigma公司)；DNAmarker(上海生工公司)；GoatantimouseIgGHRP(H+L)和3二氨基苯联胺DAB∶3(北京中杉公司)；咪唑，Nacl和Tris碱(美国BBI公司)；His

6、BindColumn(NiNTA)镍柱(美国Novagen公司).1.1.3仪器热循环仪（TMBioRadPCR，美国genecycle公司）；电泳仪（Pomol/L)2.4μL，P1(5pmol/L)3μL，P2(5pmol/L)3μL，SPNDNA1.5μL，LATaq0.4μL.在PCR仪上按下列条件进行扩增：95℃预热5min后反应30个周期：94℃1min，53℃1min，72℃1min.末轮后72℃延伸5min.取5μL反应产物置10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，DNA胶回收试剂盒回收PCR产物

7、.1.2.2TA克隆载体的构建与鉴定将回收纯化的12个PCR产物克隆至PMD18T载体，转入DH5α感受态细胞，在Amp+LB平板上培养得到多个阳性克隆，单个阳性克隆细菌经增菌后进行质粒抽提后双酶切鉴定，并将质粒送往重庆医科大学感染实验室做双向测序.1.2.3序列比对与氨基酸序列预测利用DNAssist软件，将12个重组克隆质粒双向测序的结果及预测的氨基酸序列与GenBank数据库对已公布的TIGR4SPN全基因组序列进行相似性分析.1.2.4抗原表位预测用抗原表位预测工具ANTIGENICPREDICTE

8、DANTIGENICPEPTIDES分析不同血清型SPNClpP蛋白的抗原表位及其氨基酸组成.1.2.5PETClpP重组载体的诱导表达及纯化原核表达系统pET32a(+)/ClpPE.coliBL21(DE3)在终浓度1mmol/LIPTG，37℃，250r/min条件下诱导目的重组蛋白ClpP的表达.收集的菌体超声波碎菌后，采用NiNTA柱纯化目的蛋白，以SDSPAGE和BioRad凝胶