western_blot常见问题解析

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1、WesternBlot常见问题解析1.电泳中的问题出现问题原因︶条带呈笑脸状l凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;电泳系统温度偏高︵条带呈皱眉状l可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全拖尾l样品溶解不好纹理（纵向条纹）l样品中含有不溶性颗粒条带偏斜l电极不平衡或者加样位置偏斜条带两边扩散l加样量过多2.Westernblot结果中背景高且不均匀可能的原因建议抗体浓度太高l一抗或二抗浓度太高会导致高背景，降低抗体浓度使用的封闭液不兼容l对比不同的封闭缓冲液非特异性位点封闭不足

2、l优化封闭缓冲液，最好的封闭缓冲液具有系统依赖性l提高封闭液中蛋白的浓度l优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1h或者4°C封闭过夜l在封闭液中加入Tween-20，Tween-20的终浓度为0.05%封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应l换一种不同的封闭液l不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭，牛奶含生物素l交叉反应的检测。封闭一张干净的膜，与抗体一起孵育，然后用超感应化学发光底物检测洗涤不充分，增加洗涤次数和使用缓冲液的体积l降低HRP结合物的浓度l如果洗涤液中无Tween-20，添加Tween-20使其终浓

3、度为0.05%膜的曝光时间过久l缩短印迹膜曝光到胶片的时间l按照说明书的指示，保证膜始终是湿润的l用一张新膜l保证膜完全被液体覆盖，避免其干燥l在孵育过程中始终进行震荡l小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合l不能空手持膜，始终带干净手套或用镊子缓冲液污染或结块沉淀l制备新的缓冲液抗体浓度太高l若一抗和/或二抗浓度过高会产生高背景，降低抗体浓度HRP处产生聚集体l用0.2μm过滤器过滤结合物结合可产生斑点l用一种新的高质量的结合物缓冲液中有污染l使用新的缓冲液l缓冲液使用前过滤操作设备被污染l保证电泳仪器

4、、印迹仪器和孵育用容器清洁，无外缘污染物l保证在转膜后没有凝胶留在膜上，蛋白可能黏在胶上导致背景3.Westernblot结果中信号弱或无信号可能的原因建议蛋白未转到膜上l转膜结束后，用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率。（注：总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原。）l确保转膜过程中胶与膜完全接触。l确保转印夹层排布正确l确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜l确保转印部件在电印迹过程中未过热l使用正对照和/或分子量Markerl优化转印时间和电流l确保样品制备条件优于蛋白印迹，为破坏样品的抗原性。（注意：许多蛋白

5、不能在还原状态下进行）蛋白未完全结合到膜上l在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜，需使用小孔径的膜进行。抗体不足l增加抗体浓度。抗体与目标蛋白的亲和力可能很小l抗体可能失活，可用斑点印迹检测其活性。抗体浓度太高l使用太多一抗或二抗可能导致信号迅速消失，呈现出很弱的信号。抗原不足l加入更多的蛋白进行跑胶l抗原被封闭液掩蔽l试用不同的封闭液l优化封闭液中蛋白浓度缓冲液中含有叠氮钠l叠氮钠是一种HRP的抑制剂，缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂曝光时间太短l延长胶片的曝光时间（注意

6、：超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时）底物孵育时间太短l在使用超感应底物时需进行5分钟的底物孵育。底物失活l超感应化学发光底物和超感应west膜室温状态下化学底物可保存至少12个月，超感应免疫膜化学发光底物可保存至少6个月l为衡量底物的活性，准备一个小量的工作液在一个暗室内，加入少量的HRP结合物，会观察到绿光。如果未检测到光，底物或HRP结合物均有可能失活l确保两底物无交叉污染两种底物试剂的污染可能导致活性下降膜可以修复剥离重新用探针检测l在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性l优化剥离程序l如有必

7、要可重新用探针检测l避免在同一张膜上重复进行探针检测在膜上消解抗原l封闭底物可能含有蛋白水解酶活性（如明胶）印迹膜保存时蛋白降解l准备一张新的印迹膜4.Westernblot结果中背景较高可能的原因建议膜封闭不够l延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液一抗稀释度不适宜l对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度一抗孵育的温度偏高l建议4℃结合过夜选择的膜容易产生高背景l一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低膜在实验过程中干过l实验过程中要注意保持膜的湿润检测时曝光时间过长l减少曝光时间5.Westernbl

8、ot结果中杂带较多可能的原因建议目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带l查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小目的蛋白有其它剪切本l查阅文献或生物信息学分析可能性样本处理过程中目的蛋白发生降解l加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作上样量过高，太敏感l适当减少上样量一抗不纯l纯化抗体一抗或者二抗浓度偏高l降低抗体浓度一抗特异性不高l重新选