聚乙烯醇编织构建组织工程前交叉韧带的初步研究论文

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1、聚乙烯醇编织构建组织工程前交叉韧带的初步研究论文白利明，陈鸿辉，邹海燕，叶春婷，沈雁，戴丽冰，梁佩红【摘要】目的］探讨聚乙烯醇体外编织构建组织工程前交叉韧带支架材料的可行性。［方法］用聚乙烯醇纺丝纤维编织构建韧带支架材料，在电子拉力机上测试该支架材料的力学性质；用组织块和胶原酶消化培养法在体外分离培养人前交叉韧带细胞并对细胞的生长形态和分泌胶原蛋白的特征进行检测.freelent，ACL)断裂是最常见的膝关节损伤之一。ACL断裂无法自愈，用自体或异体移植物重建ACL是目前常用的治疗方法［1］。自体移植

2、物来源有限且多有供区部位并发症；异体移植物也受来源限制，且有传播疾病和产生免疫排异的风险；人工韧带材料重建ACL的远期疗效还有争议。组织工程技术的发展和应用为ACL重建提供了新的思路和方法。本文拟用聚乙烯醇(polyvinylalcohol，PVA)编织构建韧带支架材料，经检测其性能，为临床上重建ACL提供新材料。1材料与方法1.1主要试剂与仪器Ⅰ型胶原酶(Gibco,USA)，高糖型DMEM培养基(Gibco,USA)，Ⅰ、Ⅲ型胶原单克隆兔抗鼠抗体、羊抗鼠IgG、SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生

3、物公司)，PVA纺丝纤维(委托上海东华大学材料科学与工程学院制作)，60Co辐照消毒(广州辐照技术研究中心协助)，电子拉力测试机(HounsfieldH25KSS,UK)，激光共聚焦显微镜(ZEISSLSM510META，Siemens,Germany)，扫描电子显微镜(PHILIPSESEM30)。1.2方法1.2.1支架材料的制备和力学性能检测1.2.1.1将1条PVA纺丝纤维经过钩花制作为1条丝束，4条丝束为1股，用3股丝束编织构建组织工程ACL支架材料，60Co辐照消毒灭菌(8kGy)，种

4、植细胞前使用DMEM培养基反复浸泡后过夜。1.2.1.2取6条编织好的支架材料充分浸泡湿润后，在电子拉力机上，以速度100mm／min、初始长度为1cm进行拉力测试，记录最大负荷、极限应力、最大应变及线性刚度等力学指标并绘制负荷—拉伸曲线，使用SPSS11.5软件包进行分析。1.2.2ACL细胞的分离培养及鉴定1.2.2.1取骨性关节炎患者未受损的ACL组织，参照组织块和胶原酶消化培养法［2］在体外分离培养并扩增ACL细胞。1.2.2.2将培养3～5代ACL细胞进行吖啶橙(acridineorange

5、，OA)染色，在激光共聚焦显微镜下观察ACL细胞的形态特征。1.2.2.3在ACL细胞中加Ⅰ型和Ⅲ型胶原单克隆抗体(浓度为1∶200)，阴性对照仅加PBS。按照SABC免疫组化试剂盒的步骤检测ACL细胞分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原的能力。1.2.3支架材料上种植ACL细胞1.2.3.1取3～5代ACL细胞悬液，以1×105／ml的浓度种植于支架材料上，2h后复种1次，然后在37℃、5％CO2培养箱内孵育4～6h，待细胞贴附于支架材料后，加入含10％胎牛血清的DMEM继续培养，隔天换培养液1次，7d后收集细胞—支

6、架材料复合物。1.2.3.2细胞—支架材料复合物经2.5％戊二醛固定、常规脱水、CO2临界点干燥、喷金，扫描电镜观察细胞在支架材料上的生长情况。2结果2.1编织构建的ACL支架材料无色透明，质地韧，充分浸泡后体积略有膨胀，柔韧性更强。拉力测试的负荷—拉伸曲线与韧带的拉伸曲线相似，最大负荷为52.61±6.22N，极限应力为14.96±2.28MPa，弹性模量为202.08MPa(表1)。表1聚乙烯醇编织支架材料拉力测试结果（略）2．2在体外分离培养的人ACL细胞形态呈梭形或多角形，核呈圆形或卵圆形，位

7、于细胞中央，胞质向外伸出数个长短不一的突起，呈典型的成纤维细胞特征(图1、2)。Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化测定可见ACL细胞的胞浆内富含橙黄色颗粒，主要分布在细胞核周围，胞浆外无橙黄色颗粒出现，表明ACL细胞的胞浆内富含细胞分泌的Ⅰ、Ⅲ型胶原，通过图像分析可知细胞所分泌的I型胶原明显较Ⅲ型胶原多(图3、4)。2.3电镜扫描可见支架材料孔径大小不一，相互贯通，呈三维编织网络结构；支架材料表面和孔内均有细胞生长，ACL细胞在支架材料上贴附生长并分泌细胞外基质(图5、6)。3讨论组织工程ACL的关键要素之一就是要

8、选择合适的种子细胞。ACL细胞作为韧带的结构和功能单位，在体外培养时可以较好地保持韧带细胞表型，分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原能力强，有利于韧带组织重建。CooperJA等［3］将兔ACL、内侧副韧带、髌韧带、跟腱4种成纤维细胞体外分离培养后，分别种植于编织的聚乳酸(polylacticacid，PLA)ACL支架材料上，结果发现ACL细胞分泌的Ⅰ、Ⅲ型胶原和纤连蛋白(fibronectin，FN)表达水平均高于其他3种成纤维细胞，认为ACL细胞作为组织工程ACL的种