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1、微生物发酵工程案例教学利用基因工程酵母生产抗疟疾药物前体--青蒿酸Dae-KyunRo1*,EricM.Paradise2*,MarioOuellet1,KarlJ.Fisher6,KarynL.Newman1,JohnM.Ndungu3,KimberlyA.Ho1,RachelA.Eachus1,TimothyS.Ham4,JamesKirby2,MichelleC.Y.Chang1,SydnorT.Withers2,YoichiroShiba2,RichmondSarpong3&JayD.Keasling1,
2、2,4,5（杨豫鲁翻译）摘要：疟疾这种疾病威胁着全球三至五亿人的健康，并且每年杀死超过一百万的人口。抗药疟原虫突变系Plasmodiumfalciparum2,3的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制。虽然人工合成的抗疟药以及相关疫苗已经出现，但其针对疟疾的治疗效果仍需经受严格的临床检验4，5。而青蒿素，一种从ArtemisiaannuaL（菊科植物，俗称青蒿）中提炼出来的倍半萜内酯环内过氧化物（C-15倍半萜），对抗药性疟原虫Plasmodiumspp的抑制效果非常明显。可惜的是其供给量受自然因素等各方面限制，疟疾
3、患者大都难以承受其昂贵的价格6。青蒿素的人工全合成也非常困难，而且花费很大7。不过利用微生物工程发酵合成其前体青蒿酸（一种合成青蒿素的可靠来源）,却是一个相对来说比较廉价、环保和高效的办法8，9。这里我们将介绍如何通过基因工程途径改造啤酒酵母使其高效合成青蒿酸（最高可达100ug/L）：对其甲羟戊酸途径进行调控，并且转入编码amorphadiene（ 等价于amorpha-4,11-diene，合成青蒿酸及青蒿素的最直接的前体原料）合酶和一种特异的细胞色素P450酶(CYP71AV1)的基因。这两种酶均源自青蒿，
4、而且后者经过三步氧化作用将amorpha-4,11-diene转变成青蒿酸。青蒿酸合成后被转运到胞外并附着在酵母外表面上，这意味着通过简单且廉价的纯化过程就可以获得目标产物。尽管这种基因工程酵母合成青蒿酸的能力相对于青蒿来说已经十分显著，仍需急切解决问题的是如何提高其生产效率从而扩大至工业规模生产，以便可以生产出足够多的青蒿酸来降低现有青蒿素的价格，让青蒿素综合疗法可以广泛地被应用到对疟疾的治疗中去。内容:我们通过三个步骤构建能合成青蒿酸的基因工程酵母：（1）改造酵母焦磷酸法尼酯（FPP）生物合成途径中的相关基因
5、，增加FPP的合成并且设法减少它作为固醇类物质的前体去合成固醇；（2）将青蒿中的amorphadiene合酶基因ADS转入到高FPP生产株中，从而转化FPP为amorphadiene；（3）克隆青蒿中特异的细胞色素P450酶基因（这种酶通过三步氧化将amorphadiene氧化成青蒿酸）并使其在amorphadiene生产株内表达（见图1）。青蒿素生物合成的第一步反应由ADS10催化，它已经被鉴定并且用于在大肠杆菌10微生物发酵工程案例教学图1
6、图中所示为同时表达CYP71AV1和CPR的基因工程啤酒酵母菌株EP
7、Y224中青蒿酸的合成途径。蓝颜色显示的是啤酒酵母甲羟戊酸合成途径中被直接正调节的基因；紫色显示的是因upc2-1表达被间接正调节的基因；红线指示菌株EPY224中被抑制的ERG9；绿色箭头指示从焦磷酸法呢酯到青蒿酸的生物合成途径，这条途径已经从青蒿被完全引入到啤酒酵母当中，在CYP71AV1和CPR共同作用下经过三步氧化将amorphadiene转变为青蒿酸。途径中间产物IPP,DMAPP和GPP分别代表异戊烯焦磷酸酯、二甲基丙烯焦磷酸酯和焦磷酸牻牛儿酯。中合成amorphadiene11。为了确定对是否要促进
8、细胞内FPP的合成，我们将ADS基因插入由GAL110微生物发酵工程案例教学启动子控制转录的pRS425质粒中，然后在酵母细胞中表达，结果显示单独转入ADS基因的酵母只合成少量的amorphadiene（图2，菌株EPY201，4.4mg/L）。图2
9、柱状图显示基因改造过程不同阶段啤酒酵母菌株的amorphadiene合成能力，这些菌株的详细介绍请见正文。为减小实验误差，均在同一条件下培养144小时后取样测定，amorphadiene合成水平也被定量化。纵坐标表示总产量，为平均值±标准差(n=3)。所以，为了提高
10、啤酒酵母合成amorphadiene的能力，我们对FPP合成途径进行了总共五次的基因工程改造。几个与FPP合成相关的基因的表达被正调控，而另外几个促使FPP转变成固醇的基因被负调控。同时为了保证宿主菌株的遗传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修饰都是通过染色体融合进行的。具体过程如下：首先，将一种截短的水溶性酶3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶（我们所学生化书中为译为β
