第02章 显微镜技术和显微镜在临床检验中的应用知识扩充

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1、显微镜技术与显微镜—、光学显微镜的发展历史早在公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。17世纪中叶，英国的胡克和荷兰的列文胡克，都对显微镜的发展做出了卓越的贡献。1665年前后，胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进，成为现

2、代显微镜的基本组成部分。1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜，其中九台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜，在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出成就。19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为19世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。在显微镜本身结构发展的同时，显微观察技术也在不断创新：1850年出现了偏光显微术；1893年出现了

3、干涉显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖。古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察放大的像。后来在显微镜中加入了摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄像管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图像信息采集和处理系统。目前全世界最主要的显微镜厂家主要有：奥林巴斯、蔡司、徕卡、尼康。国内厂家主要有：江南、麦克奥迪等。二、主要电镜制备技术介绍由于电子显微镜本身的分辨能力与性能在不断提高，生物样品制备技术在不断改进，以及电子显微镜技术在细胞生物

4、学研究中所发挥的巨大作用，因此，对电镜观察的生物样品有一些特殊要求：（1）要求样品很薄。电子束的穿透能力是十分有限的，即使电场高压增加到100～200kV，电子穿透生物样品的厚度仅达1μm。故此，用电镜观察样品的精细结构时，首先要求样品很薄，一般是数十纳米。即使是细菌与其它单细胞生物，假如不经过超薄切片，内部的细微结构也很难观察清楚。所以，超薄切片（ultrasection）技术是基本的电镜实验技术；（2）要求更好地保持样品的精细结构。一般样品制备都要经过一个复杂的过程：如固定、脱水、包埋、切片、染色等。所以要使样品尽量保持生活状态下的精细结构而不严重失真，对固定剂与包埋剂的选择以及固定与包

5、埋的条件均要求比较严格(一)超薄切片技术由于电子束的穿透能力有限，为获得较高分辨率，切片厚度一般仅为40～50nm，即一个直径为20um的细胞可切成几百片，故称超薄切片。这需要样品既要有一定刚性又要有一定韧性，而生物样品并不具备这些特性。为此，样品往往需要包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的结构，所以超薄切片样品制备的第一步就是样品的固定，以更好地保存细胞的精细结构。1．固定如何保持观察样品的真实性，固定是很重要的一环。固定不仅要求保持样品的形态结构不发生改变；有时甚至要求在超微和分子水平上使细胞内部的结构和成分保持在原来的位置上，同时尽量保持原来的性质，如抗原性等。超薄切片常用的

6、固定剂为锇酸和戊二醛等。根据需要选择最合适的固定剂。此外，还可以用物理方法固定，如高频微波。在固定操作过程中，动物的处死和取材都要快速进行，并通常在低温下固定，以防止酶的自溶作用造成破坏，固定的样品块也不宜太大，以便固定剂迅速渗透。表3-2几种固定剂对细胞各成分的固定效果固定剂核酸蛋白质磷脂多糖不饱和脂肪酸锇酸++++++++++戊二醛++++++KMnO4++++++++++++表示相对固定效果2．包埋包埋的目的是要使样品中各种细微结构在切片过程中都得到均匀良好地支撑，使切成的超薄切片仍能保持连续完整并且有足够的强度，并能耐受干燥以及观察时的电子轰击、高温和真空挥发。同时要求包埋剂在高倍放

7、大时也不显示其本身结构，还要求在聚合时不发生明显的收缩，以防止样品中细微结构的损坏和移位；应具有良好的机械性能（如刚度和韧性等）以利于切片；应易被电子穿透等。目前常用的包埋剂是环氧树脂。生物样品固定后通常仍含有大量水分，而包埋剂又多是与水不相溶的，因此在包埋前通常要经过一系列脱水处理过程。3．切片超薄切片厚度通常是40～50nm。切片厚度可通过样品杆的金属热膨胀或机械伸缩来控制。切片刀以玻璃或钻石为材料，最