糖尿病大鼠视网膜中vegf经由pkc-no上调icam1表达的机制探讨

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1、糖尿病大鼠视网膜中VEGF经由PKC/NO上调ICAM1表达的机制探讨：张小玲，丁延宁，朱媛，文亮【摘要】目的探讨在糖尿病大鼠的视网膜组织中，视网膜血管内皮生长因子(VEGF)通过激活蛋白激酶C(PKC)，上调一氧化氮(NO)含量，促使细胞间黏附因子1(ICAM1)升高的信号机制。方法腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型。设立正常组、糖尿病组、糖尿病大鼠PKC抑制剂组、二甲基亚砜对照组。应用硝酸还原酶法检测视网膜组织中NO含量，应用1蛋白含量。结果在糖尿病大鼠视网膜中VEGF、N

2、O含量较正常大鼠明显升高(P<0.05)。应用PKC抑制剂24h，视网膜组织中VEGF、NO含量明显下降，与二甲基亚砜对照组相比有显著差异(P<0.05)。ICAM1含量也呈现出相应的变化趋势，糖尿病大鼠视网膜中的ICAM1较正常大鼠显著增高(P<0.01)。而应用PKC抑制剂24h，ICAM1的表达明显低于二甲基亚砜对照组(P<0.01)。VEGF、NO、ICAM1的含量在二甲基亚砜对照组与糖尿病组之间的差异无统计学意义。结论链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠视网膜病变中

3、ICAM1蛋白表达升高，可能是通过VEGF/PKC/NO这一信号通路完成的。【关键词】糖尿病；视网膜；血管内皮生长因子；蛋白激酶C；一氧化氮；细胞间黏附分子1ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatehoolecule1viaproteinkinaseC(PKC)/nitricoxide(NO)pathal,diabetes,diabetes+PKCIandcontrolgroups.Diabetesonthsofstreptozotocininduceddiabetes.

4、NOinedbynitratereductasemethod.VEGFandintercellularadhesionmolecule1(ICAM1)easuredby1)　糖尿病性视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)典型的病理改变特征是视网膜血视网膜屏障(bloodretinabarrier,BRB)破坏和新生血管形成。白细胞在视网膜血管内异常地聚集，并与血管内皮细胞黏附是引起血BRB破坏的重要因素。这一异常过程是在细胞间黏附分子1(intercellulara

5、dhesionmolecule1,ICAM1)的介导下完成的[1]。目前，在DR中，ICAM1增高的机制尚未完全明了。血管内皮生长因子(vascularendothelialgroal，N)，其余40只为糖尿病实验组。实验组大鼠禁食12h，应用链脲佐菌素按60mg/kg体重腹腔注射。STZ溶于pH4.5、10mmol/L柠檬酸柠檬酸钠缓冲液中，用时配制。正常组大鼠腹腔注射柠檬酸柠檬酸钠缓冲液。注射后72h尾尖取血，血糖仪(强生稳豪Onetouch)测血糖浓度，血糖浓度≥16.7mmol/L时

6、，视为糖尿病大鼠模型建立。将糖尿病大鼠置于22～24℃环境中，每12h光照昼夜循环，食水不限，垫料每日清晨更换。在饲养期间，每月测血糖、体重，将血糖回退鼠剔除出组。糖尿病成模5个月后，将糖尿病大鼠随机分成3组：糖尿病组7只(diabetes)、糖尿病二甲基亚砜对照组6只(control)、PKC抑制剂注射组7只(PKCinhibitor)。将正常组和糖尿病组的大鼠腹腔注射过量水合氯醛处死。PKC抑制剂GF109203X(Calbiochem公司)溶解于10g/L的二甲基亚砜溶液，配制成10-5mo

7、l/L的溶液，取10μL注射入PKC抑制剂组大鼠玻璃体腔。糖尿病二甲基亚砜对照组大鼠注射10g/L的二甲基亚砜溶液10μL作为PKC抑制剂组的对照。注射方法为：100g/L水合氯醛5mL/kg麻醉大鼠，用高压消毒微量进样器，显微镜下玻璃体腔注射，注射中发生白内障及眼内出血者除去。注射后24h水合氯醛过量麻醉处死两组大鼠。1.2NO含量的检测将视网膜组织在冰生理盐水中漂洗后称重，每一张视网膜大约为0.084g。随后将视网膜组织放入1mL的玻璃匀浆器中，加入预冷的生理盐水756μL，研磨粉碎，使组织匀

8、浆化，4℃离心10min(2000r/min)，取上清备用。紫外分光光度法测定总蛋白含量。一氧化氮试剂盒(硝酸还原酶法)测定NO含量。1.3VEGF和ICAM1的检测将分离出的视网膜组织置入1mL的玻璃匀浆器中，每张视网膜加入含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的组织细胞裂解液(北京博奥森生物技术有限公司)200μL冰上充分研磨，4℃离心10min(2000r/min)，取上清测蛋白浓度，1和βactin的表达。蛋白提取物用SDSPAGE胶分离。待溴酚兰跑到胶底部时停止电泳。将分离