谈天麻素预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

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1、谈天麻素预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用长期以来，心肌缺血再灌注损伤(myocardialischemiareperfusioninjury，MIRI)一直是心血管系统疾病研究的热点之一。临床中冠状动脉痉挛的缓解、心脑血管栓塞再通、心肺手术体外循环后、心脏骤停后心肺脑复苏和器官移植中等都可能发生缺血再灌注损伤。研究表明，在MIRI时会出现氧自由基增多、钙离子超载等现象，特别是再灌注时常会发生心律失常、心肌顿抑、缺血区无复流的现象，如何减轻MIRI成为目前研究的热点。缺血预适应(ischemicpreconditioning，IPC)是指反复短暂的心肌缺血对心肌产生保护作用，

2、使心肌对更长时间缺血的耐受性增强。IPC的研究已证实能对随后的再灌注损伤产生明显的保护作用，但IPC在临床不能直接用于病人来对抗再灌注损伤，因此寻找药物预处理来对抗MIRI成为目前的研究热点。　　天麻属兰科植物，为我国常用名贵中药，天麻素是其有效成分之一，化学结构为4-羟甲基苯甲醇-β-D-吡喃葡萄糖苷。天麻素具有增加脑血流量，改善迷路动脉及内耳血供的作用;对脑缺血再灌注损伤具有保护作用;可以抑制炎症早期的渗出和阻止血栓形成;可以降低外周血管阻力、降低血压和增加动脉血管顺应性;还可增加外周及冠状动脉血流量。鉴于天麻素有着如此广泛的药理学作用，本实验通过天麻素预处理后，结扎

3、大鼠左冠状动脉前降支(leftanteriordescendingcoronary，LAD)的方法建立在体大鼠MIRI模型，观察天麻素预处理对MIRI有无保护作用并探讨其可能机制，从而为临床寻找更有效的心肌保护药物提供参考。　　1材料　　1.1实验动物与分组　　选用63只健康成年SPF级SD大鼠(安徽省实验动物中心)，雌雄不拘，(230±10)g，随机分为假手术组、生理盐水组、0.1gkg-1低浓度天麻素组、0.2gkg-1中浓度天麻素组、0.4gkg-1高浓度天麻素组、0.02gkg-1维拉帕米组。选用10只健康成年SPF级SD大鼠分为正常对照组和天麻素组进行心肌细

4、胞内钙成像测定。　　1.2主要仪器及试剂　　BL-420E生物机能实验系统、动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司);SpectraMax190酶标仪(MolecularDevices公司);激光共聚焦显微镜(德国徕卡公司);天麻素(批号:20100801，纯度:99.2%，江苏宝泽堂医药科技有限公司);维拉帕米(上海信谊药厂有限公司);血清肌酸激酶(CK-MB)检测试剂盒(上海晶天生物技术有限公司);乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);毒胡萝卜素(thapsigargin，美国默克公司);F-127、fluo-8(北京中

5、昊生物技术公司);其他试剂均为分析纯。　　2实验方法　　2.1大鼠MIRI模型制备　　上午8时对各组大鼠灌胃给药，连续7d(假手术组和生理盐水组均给予生理盐水灌胃)，于第7天灌胃后取大鼠，建立MIRI模型:用10%水合氯醛以3mLkg-1的剂量腹腔注射，麻醉后仰卧位固定于鼠板上，颈部剪毛消毒，暴露气管，做气管插管，连接呼吸机(呼吸频率60次min-1，潮气量11mL次-1，呼-吸之比为1∶2)。四肢皮下连接电极，标Ⅱ导联接BL-420E生物信号采集分析系统连续记录心电图，左侧胸部剪毛，消毒，剪开左侧胸部皮肤，在第3～4肋间隙间钝性分离肌肉，拉钩拉开切口，暴露心脏，剪开心包膜，在左心

6、耳下缘处以冠状静脉主干为标志，用5-0号带针无创缝合线进针，进针深度约1.5mm，向肺动脉圆锥方向出针，将一直径约2mm的塑料管置于结扎部位，连同塑料管一起打活结结扎LAD，缺血成功的标志为Ⅱ导联R波增宽，ST段抬高，缺血30min后，松开结扎线，再灌注2h，再灌注成功的标志为抬高的ST段下降，S波幅值恢复50%以上。假手术组术中只穿线，不结扎。　　2.2心律失常的观察　　各实验组手术操作后即记录正常期、缺血期、再灌注期的心电图，监测心电指标，观察心律失常的发生情况。　　2.3血清酶检测　　各组于缺血再灌注2h后分别从腹主动脉取血约4mL，以3500r/min-1的速度离心10mi

7、n，得到大鼠血清，分装，-20℃冰箱储存。按试剂盒说明书检测CK-MB、LDH、SOD和MDA，用酶标仪测各组吸光度值。　　2.4心肌组织形态学变化　　腹主动脉取血后，摘取大鼠心脏，置于体积分数4%福尔马林溶液中固定，在结扎线下方切取左心室前壁心肌组织，脱水、包埋、切片、脱蜡、HE染色，光学显微镜下观察各组大鼠心肌组织形态学的变化，分析天麻素预处理后对心肌组织形态学的影响。　　2.5心肌细胞内钙成像测定　　取正常SD大鼠10只，击昏，颈总动脉放血处死，快速摘取心脏，切