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1、微生物菌肥对西藏土壤微生物的影响研究 随着人们对农业生产中长期、过量施用化肥所引起的诸如土壤板结、肥力下降、面源污染和pH值降低等农业生态环境问题的关注,微生物菌肥作为改善土壤营养状况和提高植物抗逆性的作用越来越受到重视. 微生物菌肥是由一种或数种有益微生物经发酵而成的无毒害绿色生物性肥料.它通过施用于土壤后,菌肥中的微生物的生长可以矿化土壤有机养分,释放土壤闭蓄态无机养分,从而改良土壤结构和提高土壤肥力,因此微生物肥料的施用改善植物的营养条件,协助农作物吸收养分,提高植物的抗逆性. 近年来,随着生物技术
2、的不断发展,微生物肥料的研究与应用有了很大进展,但我国目前微生物肥料、生物添加剂市场种类繁多,由于气候条件、地理环境和植株种类的不同,菌肥的施用效果差异很大. 虽然近年来我国建立起了一些规范对微生物肥料市场的法规和标准,但缺乏利用分子生物学技术来科学评价、有效监测菌肥施用效果.西藏地处我国西南边陲,素以世界屋脊和地球第三极着称.藏东南地区由于受高寒低温等极端环境胁迫的影响,土壤微生物活性下降. 土壤养分矿化能力和速率也随之降低,导致土壤较贫瘠.在海拔高度4200m以上的农田中,青稞是唯一种植的作物,是藏族群
3、众的基本口粮,也是西藏地区最具特色的原料作物.因此用微生物菌肥改善当地土壤肥力条件,提高青稞的产量和质量,是维持当地经济社会健康发展的重要保障. 目前有关外来微生物菌剂对根际微生态的研究主要集中在解磷解钾菌、固氮菌及其他PGPR促生菌方面,且大多是采用传统方法,如菌落计数法等,来研究对土壤和植物的施用效果. 变性梯度凝胶电泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)技术可快速从土壤中提取微生物DNA片段,揭示所研究土壤的微生物群落结构特征,该技术在分析外源物质对土
4、壤细菌群落多样性的影响和种群动态监测方面得到广泛使用. 本研究以西藏地区广泛存在的棕色沙壤土为研究对象,在施用微生物菌肥后采用PCR-DGGE技术检测微生物菌肥对土壤微生态中细菌群落多样性的影响,研究微生物菌肥对西藏土壤微生物的影响,以期探讨微生物肥料的作用机理,并初步探究采用综合分析指标评价微生物肥料肥效的可行性. 1材料与方法 1.1试验地概况 试验地为西藏自治区农业研究所4号试验地,位于西藏自治区东南部拉萨市雅鲁藏布江支流拉萨河中游,主要地貌为河谷平原,91°02′E,29&d
5、eg;38′N,属高原山地气候,海拔3650m,年均温7.4℃,年降雨量500mm,降雨集中于6,7,8,9月份,多夜雨. 1.2试验材料 供试青稞品种为藏青320,由西藏自治区农业研究所制种.供试土壤为河谷农区棕色砂壤土,基础理化性质:全氮0.98g/kg、全磷1.72g/kg、全钾5.49g/kg、碱解氮113.05mg/kg、有效磷17.86mg/kg、速效钾31.63mg/kg、有机质13.58mg/kg、pH值7.72.供试菌剂为谷特菌肥,购买自禾康肥料有限公司,菌肥配置方法为砂糖10
6、0g,黄豆粉100g,谷特菌0.25g,1000mL水. 1.3试验设计 试验设12个处理,小区面积50m2,3次重复,施肥方式为化肥+菌肥,分根施(播种前将菌肥稀释后直接施于土壤中)和叶面喷施(三叶期后将菌肥稀释后均匀喷洒到青稞叶面上)两种. 化肥的施用量为磷酸二铵0.5kg/hm2,尿素0.33kg/hm2,氯化钾0.1kg/hm2,各处理间化肥施用量保持一致,不同处理的谷特菌肥的施用量见表1-a,b.种植时间为2011年5月初,种植期间施肥、灌溉、中耕除草等统一管理.【表1】 青稞收获后,
7、在试验小区内用土钻S形随机选择5个点,采样深度为0~20cm,除去可见动植物残体及小石块后混匀.用于测定土壤微生物量的土壤样品保存在4℃冰箱中.用于PCR-DGGE分析的样品迅速冻存于-20℃冰箱,以进行分子生物学实验. 1.4测定项目及方法 1.4.1土壤中可培养真菌、放线菌数量及微生物量氮的测定土壤中可培养真菌及放线菌的分离和数量测定采用稀释平板法,培养基分别为葡萄糖酵母膏培养基及高氏1号培养基.微生物量氮测定采用氯仿熏蒸提取法. 1.4.2细菌基因组DNA的提取及PCR扩增 1)称取0.5
8、g土样,用OMEGA公司E.Z.N.ASoilDNAKitD5625-01提取DNA,得到的DNA用1%琼脂糖电泳检测,并用紫外分光光度计测定其浓度和纯度.由于土壤中含有腐殖酸,影响DNA的扩增,本研究采用稀释20倍的土壤DNA进行扩增. 2)将基因组DNA作为PCR的模板,采用细菌16SrRNA的V3区特异性引物对F338-GC和R518进行PCR扩增.它们的序列分别为338F-G
