血栓心脉宁片激活nrf2及其下游基因

《血栓心脉宁片激活nrf2及其下游基因》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、血栓心脉宁片激活Nrf2及其下游基因可能与血栓心脉宁片在HUVECs中的抗氧化活性相关吉林大学基础医学院病原生物学系熊凌锌谢婧书宋晨雪郑敬彤张晓天王放吉林大学药学院刘金平刘传贵李平亚流行病学研究表明,抗氧化活性在保护血管内皮细胞中扮演重要角色。本试验的目的在于研究传统中药血栓心脉宁片（XXT）的抗氧化活性和Nrf2（转录因子NF-E2相关因子）调控基因的差异性表达。结果表明,XXT可强烈激活Nrf2及其下游调控基因，这可能与XXT的抗氧化活性及血管内皮细胞的保护活性相关。前言十多年来，因XXT可促进血

2、液循环、去除血瘀，在中国被广泛应用于脑血栓和冠心病的治疗。氧化与包括高血压、高胆甾醇血症在内的所有的心脑血管疾病有关，可通过激活产生活性氧（ROS）的NADPH氧化酶参与这些疾病的形成。因此，我们研究XXT的体外抗氧化活性。Nrf2系统被认为是一种主要的抗氧化保护机制，在细胞防御中发挥作用，也可通过激活编码Ⅱ期解毒酶和抗氧化酶的基因促进ROS的去除。通常条件下，Nrf2与可结合肌动蛋白的Keap1结合，二者形成Keap1-Nrf2复合体。这种复合体可阻止Nrf2进入细胞核，促进其蛋白酶降解。当用包括H

3、2O2在内的氧化物刺激细胞时，氧化应激和构象变化可作为硫醇敏感型氨基酸的氧化结果，并驱使Nrf2与Keap1分离。随后Nrf2转移至细胞核，结合ARE靶基因的抗氧化反应成分（ARE），导致抗氧化酶表达上调。在本试验中，我们旨在研究可控制抗氧化基因和ROS的Nrf2及其下游基因的转录调控，并研究XXT的抗氧化活性是否受Nrf2的调控。研究方法细胞培养和用药在加15%胎牛血清的IMDM培养基中培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）（37℃、5%CO2）。测试期培养基用含2%FBS的IMDM换液。将所培养的细

4、胞分为5组：对照组（NC）、氧化应激模型组（Model）、三个XXT加药组（包括高剂量组（200μg/ml）、中剂量组（100μg/ml）和低剂量组（50μg/ml）。NC组细胞用0.2mMH2O2处理4h，XXT加药组细胞在H2O2处理24h前用XXT（200、100、50μg/ml）预处理。H2O2的浓度根据H2O2的IC50确定，但XXT的浓度根据筛选研究确定。用MTT法评估细胞存活。细胞内ROS水平的检测用ROS试剂盒检测HUVECs细胞中的ROS水平。为了检测ROS水平，加药20min后将H

5、UVECs于37℃黑暗环境中的10μMDCFH-DA孵育。随后流式检测细胞。氧化应激PCRArray用人源氧化应激PCRArray检测84种氧化相关基因的表达。用RNeasyMiniKit将HUVECs的总RNA提取，用UNIC2800UV/VIS分光光度计检测波长为260nm和280nm时的吸光度，从而评估RNA提取物的量。用RNase-FreeDNaseSet纯化总RNA，并用RT2FistStandKit进行逆转录反应，获得cDNA，使用RT2SYBRGreenROXqPCRMastermix进

6、行PCR反应。用ABIPrismSDS7300system进行热循环。用Ct值比较不同组的基因表达，所得数值用△△Ct法计算（将五种常见基因（ACTB、B2M、GAPDH、HPRT和RPL13A）的平均表达水平正态化。Real-TimePCR如先前描述的那样，用RNeasyMiniKit将HUVECs的总RNA提取，用分光光度计检测RNA提取物的量。将总RNA用PrimeScriptRTReagentKit和gDNAEraser转录。用Real-TimePCR和SYBRPremixExTaq检测cDN

7、A。用ABIPrismSDS7300system进行热循环。如先前描述的那样，用Ct值比较不同组的基因表达。WesternBlotting加药后收集细胞，并在RIPA缓冲液裂解细胞。每条带25μg蛋白负载至SDS-PAGE胶上，转膜至硝化纤维素膜。随后封闭膜，用靶蛋白（β-actin、Nrf2、Keap1、GCLM、NQO1和HMOX1）相对应的抗体检测，并用合适的二抗孵育2h。加染色溶液混合物，曝光后检测免疫反应条带。数据分析数据用平均值±标准差表示，并用t检验分析数据。P<0.05表示数据有显著差

8、异。三组间数据的比较用单因素ANOVA分析，qPCR结果用非参数Mann-WhitneyU数据检测法分析。以上的分析过程用SPSS软件操作。结果H2O2可剂量依赖性诱导细胞毒性用不同浓度XXT处理HUVECs细胞4h，并检测氧化应激。结果表明：加H2O2会导致剂量依赖性氧化应激。加0.2mM后会使细胞数量减少51.74%（图1）。因此此浓度可以作为HUVECs用H2O2处理后的IC50。XXT对H2O2诱导的HUVECs氧化应激的作用H2O2处理后的HU