活体动物光学成像技术与应用研究

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1、活体动物光学成像技术与应用研究　　摘要：活体动物光学成像是利用生物发光及荧光技术在活体动物体内进行生物标记通过光学成像系统来监测被标记动物体内分子及细胞等的生物学过程。按发光模式可分为生物发光和荧光两类。相对于传统动物实验研究方法，具有无创、可多次重复、实时活体成像、灵敏、安全等优势，这项技术在标记活体内肿瘤活体细胞示踪、标记基因及转基因动物等方面的应用广泛。关键词：活体成像；生物发光；荧光；应用传统实验设计动物研究时，常采用的方法是处死老鼠，解剖后通过肉眼观察脏器病理变化，再组织切片观察等，无法动态监测整个活体内生物学事件的

2、发生、发展，而活体动物光学成像（opticalinvivoimaging）9主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）2种技术在活体动物体内进行生物标记，通过成像系统可以动态或静态监测被标记分子或细胞在活体动物体等的发展进程，以及观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程[1-3]。生物发光是通过荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基因（GFP、RFP及dyes等）进行标记。两者的主要区别在于生物发光是动物

3、体内的自发荧光，不需要激发光源，而荧光则需要外界激发光源的激发出荧光再通过检测器检测，就可以直接观察到被测物体内的细胞运动和基因行为。1原理与分类活体动物光学成像技术是指在活体动物体内利用报告基因-荧光素酶基因表达使其产生的荧光素酶蛋白再与小分子底物荧光素作用，需在氧、Mg2+存在的条件下消耗ATP之后发生氧化反应，这时将产生的化学能量转化变为可见光能释放，最后在体外再利用敏感的检测器CCD设备形成图像。荧光素酶基因可以被插入多种基因的启动子（promoter），成为某种基因的报告基因，通过监测报告基因从而实现对目标基因的监测

4、。1.1生物发光技术生物发光荧光实质是一种化学发光，其过程需要底物萤火虫荧光素酶的参与，通过氧化其特有底物的过程中，将会释放可见光光子，其波长广泛约为560nm（460～630nm），甚至包括超过600nm的重要的波长红光范围。在哺乳动物体内吸收可见光的主要成分是血红蛋白，能吸收中蓝绿光波段的大部分可见光；吸收红外线主要是水和脂质，但均对波长为590～800nm的红光至近红外线吸收能力较差，因此波长范围在红光超过6009nm的区域即使有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳动物组织被敏感的CCD检测器检测到。常用方法是构建荧光素酶基

5、因表达载体转染目标细胞，并移植到受体靶器官中，观察时注入外源荧光素，目标细胞内即可发生反应产生荧光，通过活体动物光学成像系统（如IVISspectrum系统）就可以检测生物发光[4]。生物发光技术因为有着较高的灵敏度，最少可以检测到小动物体内102个细胞此外，还具有对环境变化反应迅速、成像速度快、图像清晰等优点[5]。1.2荧光成像技术与生物发光不同，荧光发光不需要底物的参与，但需要外部的激发光源，利用激发光使荧光基团（如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或者荧光染料）达到较高的能量水平，然后发射出波长较长的发射光[6]。荧光成像技术

6、的信号水平取决于发光细胞的数量及激发光的强度，光线穿过的组织对其有强烈的吸收，而且小动物的皮肤、毛发、软骨和体内的食物等都会产生荧光，将会对目标信号产生干扰，因此荧光成像技术的敏感性较生物发光技术差，荧光强度会随着目标深度的增加而成递减。但是荧光成像技术具有标记靶点的多样性、一次可以应用不同的荧光基因标记不同的细胞的优势，因而在进行一些分子生物学以及小分子体内代谢研究中得到了广泛应用[7]。2成像过程9活体动物光学成像系统一般由高灵敏度的低温CCD相机、成像暗箱和成像软件组成。一般成像过程是：小动物麻醉后放入成像暗箱平台，也可

7、以同时检测多只动物，只需要调整控制平台升降到一个合适的视野，选择合适的条件，对于荧光成像，需要选择合适的滤光片，开启激发光源，激发荧光物质而发光，拍摄出背景图与小动物体内发出的光，将其叠加可以清晰地显示活体内发光情况，完成图像采集。最后可以通过软件对图像进行分析，当选定需要测量的区域后，软件可以计算出此区域发出的光子数，获得实验数据[8]。3优势比较目前的活体生物体内成像技术，如超生（ultrasound）、计算机断（ComputedTomography，CT）、核磁共振（MagneticTesonanceimaging，MR

8、I）、正电子衍射成像（Positron-EmissionTomography，PET）、单光子衍射（Single-Photon-EmissionComputedTomography，SPECT）等技术，活体动物体内光学成像具有许多独特的优势：①无创性，②操作简便，③测量快，④