分离马齿苋内生放线菌的思路

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1、分离马齿苋内生放线菌的思路摘要：近年来发现的新的生物活性物质有51%来自植物内生菌的新物种，而仅有38%来自土壤微生物，可见植物内生菌资源巨大的开发潜力。马齿苋作为一种药用植物，其内生放线菌尚没有学者对其进行研究。本文从菌种的分离、菌株的多样性分析、抑菌活性菌株的筛选和新的物种的鉴定四个方面，概括了马齿苋内生放线菌的研究思路。关键词：马齿苋；放线菌；菌株中图分类号：G642文献标志码：A文章编号：1674-9324（2014）32-0168-026植物内生菌是一类相对未开发的微生物资源，目前已经受到越来越多学者的关注。据报道，近年来发现的新的生物活性物质有51%分离自植物内

2、生菌的新物种，而仅有38%分离自土壤微生物，可见植物内生菌资源巨大的开发潜力。植物内生菌普遍存在于目前已经研究过的各种类型的植物中。目前全世界至少已在80多个属290多种禾本科植物中发现有内生真菌。20世纪70年代后期，内生菌在一些重要的经济林木，如冷杉、云杉、紫杉等植物树皮、枝叶中相继被发现并得到了广泛的研究。同时在多种灌木、草本植物以及栽培植物、果树等发现了大量的内生菌。从目前研究来看，尚未发现没有分离到内生菌的植株，因此可以推断内生菌在马齿苋体内是普遍存在的。马齿苋（PortulacaoleraceaL.）为马齿苋科一年生草本植物，《中华人民共和国药典》2010年版记

3、载，马齿苋的功能与主治包括：清热解毒，凉血止血，止痢。用于热毒血痢，痈肿疔疮，湿疹，丹毒，蛇虫咬伤，便血，痔血，崩漏下血。其药用价值体现为以下几个方面：预防和治疗糖尿病、降血脂和防治动脉粥样硬化、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤和提高机体免疫、抗细菌作用等六个方面。放线菌一直是抗生素、酶和酶抑制剂等有用生理活性物质的主要产生菌。云南独特的气候环境蕴藏着丰富的生物资源，马齿苋内生放线菌的研究意义重大。一、菌种的分离植物内生菌大多生存于植物组织的内部，它们或定植于植物组织细胞内部或定植于组织细胞之间，与植物组织紧密相连。植物内生菌的这一定植特点必然会给内生菌的分离带来较大的障碍。内生菌与

4、植物组织是否能达到较为充分的分离，成为影响植物内生菌分离的一个重要环节。1.分离菌株的多样性分析。通过形态观察、气生菌丝、基内菌丝、可溶性色素的比较等进行排除重复，将这些菌株进行培养，分别提取其基因组DNA，并根据细菌的16SrRNA基因通用引物来扩增已筛选出来的16SrRNA基因，同时进行16SrRNA基因序列测定，按照Cui等使用的方法进行。将分离株的16S6rRNA基因序列提交到GenBank进行基因注册，用Blast搜索软件从GenBank、DDBJ和ENBL等公共数据库中进行相似性搜索，调处相似性最高的相关菌株的16SrRNA基因序列，用相关软件进行序列比对、相似

5、性计算、进化距离矩阵计算、聚类分析和系统进化树构建等系统发育分析。采用16SrRNA基因序列相似性小于97%的菌株属于不同物种的归类原则，采用Shannonwinner指数（H）和均匀度指数（E）估算多样性。2.内生放线菌的抗癌、抑菌活性筛选。放线菌作为一种重要的微生物资源，从中筛选抗生素类物质的几率要远比其他类群的微生物高。随着微生物资源研究的深入，从传统的土壤放线菌中寻找新的具生物活性的物质越来越难。近年来，人们从微生物中分离得倒的化合物，有近99.9%是重复发现的。因此必须不断开发新的微生物菌种资源来寻找新的微生物次级代谢活性物质，而内生菌作为一个相对未开放的资源，是

6、新基因和新物种的一个丰富而可靠的资源，新基因和新物种通常又意味着新的天然产物及新的活性物质。马齿苋内生放线菌作为一个新的微生物资源，蕴含着丰富的放线菌类群，从这些内生放线菌菌群出发进行活性物质的筛选工作，或许能寻找到新的抗癌药物或抗生素类物质二、新的物种的鉴定6对马齿苋的内生放线菌进行分离培养中，加入得到了一株极有可能为新种的放线菌，应当对该菌作进一步的多相分类鉴定。1.形态和培养特征。形态观察，将菌株接种在含培养基的平板上，进行埋片培养，先用光学显微镜观察形态，并选择生长密度适宜的埋片喷金镀膜，进行电镜观察。参照国际链霉菌规划中有关放线菌的培养特征描述所采用的标准培养基进

7、行。观察基内菌丝、气生菌丝的生长情况和颜色，可溶性色素是否产生及产生的颜色。2.生理生化特征。菌株的生理生化特征的选择主要根据伯杰氏手册中相应属、种有关内容进行。主要有PH耐受实验、盐浓度耐受实验、温度实验、唯一碳、氮源生长实验、酶的产生、明胶液化、牛奶胨化和凝固、纤维素生长、硝酸盐还原、硫化氢产生、尿素的利用和黑色素的产生等实验。3.细胞化学特征。利用快速薄层层析法进行全细胞氨基酸及全细胞水解液糖型的分析。参照Minnikin和Collins，M.D.的方法进行磷酸类脂的提前、纯化及组分分析。参照Collins，