简析分子生物技术在厌氧氨氧化工艺研究中的应用

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1、简析分子生物技术在厌氧氨氧化工艺研究中的应用厌氧氨氧化(anammox)工艺是由荷兰Delft大学于1990年研究开发，并在实际废水处理中得到成功应用的一种新型废水生物脱氮工艺。它以anammox反应为基础，该反应依靠厌氧氨氧化菌(AnAOB)特殊的代谢机制，在厌氧条件下，以氨为电子供体，亚硝酸盐为电子受体反应生成氮气。Anammox工艺以高效低耗的优势在废水生物脱氮领域具有广阔的应用前景。然而，由于AnAOB倍增时间很长(11d)，迄今为止仍未获得AnAOB的纯培物，且anammox反应器中微生物的种类、丰度及相互

2、之间的关系一直被认为是黑匣子，所以传统的微生物分析方法基于纯培物的分离进行形态、代谢、生化和遗传分析的方法，受到了很大的限制。　　20世纪90年代发展起来的一套新的分子生物技术彻底改变了微生物学研究，与传统的研究方法不同的是，它不需要将微生物分离就可以鉴别特定种群，已成为微生物生物学特性研究的新平台。分子生物技术近年来发展迅速，尤其在anammox工艺等废水脱氮研究领域崭露头角，它基于有分子进化钟之称的小核糖体亚基的RNA(原核生物为16SrRNA)及其相应的基因进行研究。在这些技术中，DGGE、FISH、qPCR、

3、高通量测序和基因芯片等以独特的优势脱颖而出，具有一定的代表性。DGGE、FISH和高通量测序技术能够将anammox工艺中微生物的种类、丰度及群落关系可视化，qPCR可以作为指示参数直接监测反应器内AnAOB的数量变化，同时，基因芯片(GeoChip)能够将微生物群落结构与功能紧密结合，这对于全面认识厌氧氨氧化菌的性质，解析厌氧氨氧化工艺的微生物学机理，快速启动anammox工艺及提高其性能的有重要意义。　　文章重点介绍了DGGE、qPCR、FISH、高通量测序和基因芯片等分子生物技术在anammox工艺研究的应用，

4、并总结其主要的优缺点。这些技术最近已经开发，主要用于实验室规模，在不久的将来，这些技术会成为设计和管理生产规模anammox工艺的评估工具。　　1变性梯度凝胶电泳　　分子指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳(DGGE)，温度梯度凝胶电泳(Temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE)和末端限制性片段长度多态性分析(Terminal-restrictionfragmentlengthpolymor-phism，T-RFLP)，在这些技术中，较为常用的是DGGE。根据DNA分子在不同梯

5、度的变性剂中解链行为的不同而具有不同电泳迁移率的特点，将片段大小相等而碱基组成不同的DNA片段分开，每个条带代表一个微生物种类，DGGE产生的结果可以直接反映群落多样性。同时，也可以通过回收目的条带进行片段测序获得系统发育信息。　　目前，已发现并鉴定的AnAOB有6属19种(表1)，其中大部分AnAOB分离自污水处理厂或实验室反应器样品，少部分分离自海水样品，但均没有获得纯培物。Strous等最早采用PCR-DGGE技术鉴定一种新的AnAOB，并命名为CandidatusBrocadiaanammoxidans。Sc

6、hmid等基于PCR-DGGE方法在德国几个污水处理厂发现了新的16SrRNA序列，与已发现的CandidatusBrocadiaanammoxidans的16SrRNA序列相似性小于90%，因此，这种新的AnAOB被命名为CandidatusKueneniastuttgartiensis。Park等研究了不同接种源和运行方式对anammox反应器中微生物群落的影响，通过PCR-DGGE分析发现，随着序批式反应器(SBR)稳定运行，其中AnAOB的优势菌从CandidatusKueneniastuttgartiens

7、is转变为CandidatusBrocadiafulgida和CandidatuBrocadiasp.40，全程自养脱氮反应器(CANON)也逐渐以CandidatusBrocadiasp.40为优势菌，结果表明反应器中接种源和运行方式对AnAOB优势种的选择不大重要。结合PCR技术，DGGE可以简单分析出反应器中菌群的种类，可以作为AnAOB富集简单的检测指标。　　2荧光原位杂交　　核酸杂交法利用短的寡核苷酸探针(约15~25bp)特异性结合目标核酸，从而检测原位或非原位细胞。斑点印迹法是一种非原位方法，通过评估基

8、因表达水平的相对变化来探究一个群落的代谢活动，然而由于基因表达模式与环境条件显著相关，这种技术用于微生物量化有一定的局限性。荧光原位杂交(FluorescenceinSituHybridization，FISH)是用荧光标记的已知核苷酸序列的探针在细胞内和特异的互补核酸序列杂交，通过激发的荧光信号来检测样品的方法。基于其原位的性质，通过荧光显微