用原子力显微镜表征dna纯化效果的实验研究

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1、用原子力显微镜表征DNA纯化效果的实验研究作者：熊洁，陈宝安，巴龙，高峰，高冲，丁家华，孙耘玉，程坚，王骏，赵刚，杜鹃，陆祖宏［摘要］　　目的：运用原子力显微镜(AFM)表征3种DNA纯化试剂盒对DNA的纯化效果。方法：PCR扩增K562/A02细胞mdr1基因DNA,分别以3种不同的DNA纯化试剂盒对ＰＣＲ产物进行纯化后，按终浓度为10ng・μl-1固定在用1ng・μl-1L型多聚赖氨酸预先处理过的新剥离的云母片上，用AFM获取DNA扫描图像，分析评价3种DNA试剂盒对DNA的纯化效果。结果:用AFM成

2、功表征3种纯化试剂盒纯化后DNA片段，获得了清晰的DNA图像。对3种DNA纯化试剂盒的纯化效果作出评价，建议其中的两种DNA纯化试剂盒的DNA纯化产物可用于AFM的DNA分析。结论：用AFM表征DNA时对DNA的纯度要求较高。通过对3种DNA纯化试剂盒纯化效果的比较，为AFM观测DNA样本的纯化方法提供了较好的方案。　　［关键词］原子力显微镜;表征;脱氧核糖核酸;纯化　　Abstract：ObjectiveToidentificatepurificationeffectofthreekindsofDNApurificationkit

3、sbyatomicforcemicroscopy(AFM).MethodsCultivatEionandPCRtechniqueplifyK562/A02cellsdr1gene.Theamplifiedproductsplesicatreatedby1ng・μl-1Lpolylysine.AFMagingofthethreepiecesofDNAsamples.ResultsThroughAFMimageanalyzing,thepurificationeffectofthreekindsofDNApurificat

4、ionkitsplesforAFMimaging.ConclusionThehigherthepurifyofDNAsampleused,thebettertheAFMimagegot.TeshavebeenachievedforDNAimagingusingAFMthroughparingthreekindsofDNApurificationkits.　　Keyicforcemicroscope;identification；deoxyribonuclEIcacid;purification　　原子力显微镜（atomicforce

5、microscope，AFM）是具有原子级分辨率的新一代显微镜，因其能够对DNA、蛋白质、磷脂生物膜、多糖等生物大分子以及有机化合物的形态及功能进行观察研究而引起了人们的广泛关注［1］。近十几年，运用AFM在固相载体表面研究DNA分子技术取得的巨大进步,大大地增进了人们在分子层面上对DNA分子的了解［25］。AFM在样本制备上相对较容易，但用于DNA研究时，要想得到质量较高的DNA图像对DNA样品的纯度要求较高。我们选择了3种不同的DNA纯化试剂盒对K562/A02细胞株mdr1基因769bpDNA的PCR产物进行纯化后在相同条件下

6、用AFM观测，通过比较，建议其中的两种可用于AFM的DNA样品的纯化。　　1材料和方法　　1.1细胞培养　　K562/A02细胞株由中国医学科学院血液学研究所杨纯正、齐静老师惠赠。细胞接种于含10%小牛血清的RPMI1640(Gibco/BRL公司产品)培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养，2~3d传代1次，实验前无药培养两周。　　1.2DNA提取　　取对数生长期、终浓度2×105ml-1的K562/A02细胞3ml，以酚/氯仿法抽DNA后，加100μlTE缓冲液于-20℃保存。用紫外分光光度计定量，要求A260/A280

7、≥1.8。　　1.3PCR扩增　　从基因库中查得所需mdr1的基因序列号，引物根据基因库提供的基因全序列用计算机软件Primer3设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列：上游5′ATACTTTACTCCTTCCTTCAA3′，下游5′TCTGAATAAAGTAGATTTCTTCATG3′,扩增K562/A02细胞mdr1基因-758～＋11的DNA,片段长度为769bp。PCR反应体系：纯化的DNA模板2.5μ1，50pmol・L-1上下游引物各1μ1，25mmol・L-1MgCl21.5

8、μ1，dNTP4μ1，5×PrimeStaRTM缓冲液(含Mg2＋)10μ1，10mmol・L-1PrimeStaRHSDNA聚合酶0.5U,余用灭菌去离子水补至50μ1。热循环参数为：98℃变性10s，55℃退火10s