探讨照山白抗癌细胞的作用机制

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1、探讨照山白抗癌细胞的作用机制　　照山白(ＲhododendronmicranthumTurcz)，又名万经棵、照山白杜鹃，属于杜鹃花科杜鹃花属植物小花杜鹃。主要分布在我国东北、华北等地。　　　　照山白中含有皂苷、鞣质、还原性物质、多糖、黄酮、油脂和挥发油等多种化学成分，目前对照山白化学成分报道较少。从传统的中医记载看，照山白有祛风通络、调经止痛、化痰止咳的作用。枝叶入药，用于慢性气管炎、风湿麻痹、痛经、产后关节痛、高血压等。但对照山白单体如金丝桃苷(Hy-perin)成分的研究及抗氧化损伤和抗肿

2、瘤作用研究鲜有报道。已有学者证实照山白提取物可有效抑制多种癌细胞的增长，诱导癌细胞的凋亡，具有抗肿瘤的作用，但其促进细胞凋亡的途径及分子生物学机制尚不明确。　　　　细胞凋亡或称程序性细胞死亡(programmedcelldeath，PCD)，近年来发现细胞凋亡与许多疾病尤其是肿瘤有密切关系，在肿瘤的发生发展中往往伴有抑凋亡基因的表达增强或促凋亡基因表达的受抑，因而细胞凋亡的研究对肿瘤的发生、预防和治疗都有着广阔的前景。然而目前中药成分抗肿瘤在分子水平上的研究尚不深入，为了进一步探讨照山白抗癌细胞

3、的作用机制，本实验应用MTT法，流式细胞术PI染色、及a公司;胰蛋白酶－EDTA消化液购自北京Solarbio科技有限公司。　　　　1．1．2照山白金丝桃苷单体的制备　　　　金丝桃苷由泰山医学院药物化学合成教研室提供。根据已有文献［6］从泰山杜鹃属植物照山白枝叶中提取，纯化，经与对照品比对，高效液相色谱法测定纯度在98%以上。将金丝桃苷溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，作为原液，储存在－20℃，并在实验前用培养基稀释。整个研究过程中DMSO的终浓度的不超过0.1%，对照组相应的用含0．1%DMSO

4、培养基处理。　　　　1．1．3细胞培养及干预　　　　将MCF－7细胞置于含10%FBS的ＲPMI－1640培养基中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，80%～85%融合率后常规传代。　　　　1．2方法　　　　1．2．1MTT法检测细胞生长　　　　取对数生长期细胞，制成1105/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100μl培养过夜，PBS洗涤，实验组分别加入浓度为1μg/L、10μg/L、100μg/L、1mg/L、2mg/L的金丝桃苷，对照组只加培养

5、基。　　　　金丝桃苷组分别继续培养24h、48h、72h、96h、120h后，加入MTT溶液(5mg/ml)10μl继续培养4h，弃去各孔内液体，每孔加入100μl二甲基亚砜，置振荡器上振荡5min，使细胞内和周围的紫色颗粒充分溶解，室温放置10min，于全自动酶标仪上测定各孔A490nm值，取3孔平均值计算细胞抑制率:抑制率%=(1－实验组A值)/对照组A值100%。　　　　1．2．2流式细胞仪　　　　PI染色分析各实验组细胞周期变化:以含10%FBS的ＲPMI－1640培养液调整

6、细胞密度至每毫升1105个，按每瓶2ml接种于25ml的细胞培养瓶，每48h更换培养液1次。待细胞融合率为80%～85%时，无血清培养使细胞同步化于G0期，然后按分组分别加金丝桃苷处理24h。细胞分组如下。对照组:仅含培养基;金丝桃苷低、中、高剂量处理组:(10μg/L、100μg/L、1mg/L)。取出各处理组细胞培养瓶，胰蛋白酶消化，分别收集细胞入试管中。以1000转/分离心5min，弃上清，加入4℃PBS缓冲液，涡旋混匀，再离心，洗涤细胞2次。4℃70%的乙醇约0．5ml贴壁缓

7、慢加入试管中固定细胞。以1800转/分离心5min，弃去固定液。再加PBS离心洗涤细胞1次。每106细胞加入500U的ＲNA酶，置37℃孵育30min。离心去除ＲNA酶，再经PBS洗1次，离心去上清液。加入50mg/L的PIlml，室温下避光染色20min后，300目尼龙X过滤。上流式细胞仪测定(激发波长488nm，氢离子激光)，用multcycleDNA分析软件包进行细胞周期分析。　　　　1．2．3期细胞比率显著增多，提示细胞分裂被明显抑制，复制不完全，正常细胞周期被阻断。而在下一步的实验中，

8、促进通过细胞周期G2/M期检验点的细胞周期调节蛋白cyclinA与CDK2表达下降，同时凋亡家族的最后通路caspase3表达增高，可见金丝桃苷抑制肿瘤细胞的生长与细胞周期阻滞，促进细胞凋亡有关。　　　　目前认为除既往研究较清楚的两个主要通路:　　　　细胞凋亡的细胞膜死亡受体通路;细胞色素C释放和caspases激活的线粒体途经。细胞凋亡不仅在维持细胞群体数量的稳定、胚胎发育和免疫系统的克隆选择方面起着作用，而且在肿瘤发生、发展及抗肿瘤治疗等方面有十分重要的作用［9］。研究细胞凋亡对肿瘤的发生发