基于miseq法纳豆冻干粉对小鼠肠道菌群影响的研究

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1、基于Miseq法纳豆冻干粉对小鼠肠道群影响的研究黄占旺王素贞吴高峰吴少福黄永平陈佳妮江西农业大学食品科学与工程学院江西省天然产物与功能食品重点实验室抗生素近年来被滥用，它抑制或杀死微生物使得机体菌群失调。因此找出一种抗生素的安全有效替代物非常有必要，而益生菌是一种有效的替代物。木研宄以纳豆冻干粉为原料，正常小鼠和肠道菌群失衡小鼠为动物试验模型，采用体内灌H试验和Miseq方法研究纳豆冻干粉对小鼠肠道菌群的影响并进行生物信息分析。分析多样本间的肠道菌群多样性和单样本属水平上的分类情况;分析纳豆芽孢杆菌及益生菌、致病菌的菌数变化情况。预期的研究结果为揭示纳豆芽孢杆菌的肠道菌群调节机理提供科学依

2、据，对人类健康和传统发酵食品微牛.物的开发具有十分重要的意义。关键词：纳豆冻干粉;肠道菌群;Miseq法;多样性;抗生素在杀死细菌的同时会筛选耐药细菌，使得抗生素失去治疗效果。因此寻找一种安全并且对机体肠道有益的抗生素替代物非常有必要。纳豆是由纳豆芽孢杆菌发酵大豆制成的，不仅保有大豆的营养价值，而丑还富含维生素1<2等活性成分［3-4］，能有效提高蛋白质的消化吸收率m，具有溶解体内纤维蛋白M、防治“三高”、溶血栓、醒酒等功能m。近年来，研究者对于纳豆芽孢杆菌的研究越来越多，毡括纳豆菌的选育以及纳豆菌与其他功能成分复合研究、纳豆激酶的研究及产品开发等。然而，纳豆的研究还存在不足，纳豆屮的一些

3、功能性物质未探究清楚，纳豆冻干粉对肠道菌群的影响缺乏全面分析。高通量测序方法（Miseq方法）是最近10年新兴发展起来的免培养分子生物学技术，又称新一代测序技术。目前，高通量测序技术已被广泛应用于动物肠道、食品、土壤、根际、植物内部、水体等多种微生态的研究中M，有助于全面了解食品中微生物群落动态和生理活性，以便提高食品质量和控制其微生物安全M。因此，木研宄以纳豆冻干粉为原料，正常小鼠和抗生素建立肠道菌群失衡小鼠为动物模型，采用体内试验和Miseq方法研究纳豆冻干粉对小鼠肠道菌群的影响并进行生物信息分析。1材料与方法1.1材料与试剂纳豆冻干粉（NLP）:实验室自制;KM小鼠:雌性SPF级，湖

4、南斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证号:SCXK（湘）2011-0003,饲料质量合格证号:SCXK（湘）2014-0002;盐酸林可霉素（批号:20130902）、氨苄青霉素（批号：104D038）:Solarbio公司；头孢唑啉钠:梯希爱TC1（上海）化成工业发展有限公司；FastDMASoilKit:美国MPBiomedicals公司。1.2主要仪器设备TDL-5-A低速离心机:上海安亭科学仪器厂;凝胶电泳成像系统:美国Kodak公司;PCR反应仪:美国BioRad公司；高通量测序仪：屮国Illumina公司；生物分析仪：美国Agilenttechnologies公司美国Na

5、noDropTechnologies公司。1.3方法1.3.1纳豆冻干粉的制备：取300g左右大豆，洗净浸泡20h并不断换水，在121°C下蒸煮30min,用手捏碎即可，在温度降到不烫手时，加入10%的纳豆芽孢杆菌菌液于大豆表面，充分搅拌均匀，在37°C生化培养箱中固态发酵24h,然后等其降到室温时放入4°C冰箱屮后熟12h,加入15%脱脂奶粉，真空冷冻干燥后，用高速粉碎机粉碎,即制成纳豆冻干粉。1.3.2样品采集KM雌性小鼠128只，18~22g,在SPF小鼠生长环境下饲养。小鼠适应性饲养5d，随机分为8个组，每组16只，组间体重差异不大于0.5g。把NLP配制成10、100、400mg

6、/mL的溶液。选取1组为空白对照组A,灌H生理盐水;其余组灌H抗生素混合溶液（盐酸林可霉素、头孢唑林钠、氨苄青霉素，浓度均为100mg/mL）建模3d后，随机选取4组作为调节组，B组灌胃生理盐水，广H灌胃3个剂量的NLP;L组作为模型组，灌胃抗生素溶液。试验期为30d,灌胃量均为0.5mL/只。每天16点无菌收集小鼠粪便，置于标记好的EP管中，_80°C下保存。取0、3、18、33、48d5时间点(5个时间点之间的时间段分别称为I,II,III,IV期)的小鼠粪便样品进行后续DNA提取。1.3.3DNA提取每个样品分别称取约500rog后利用FastDNASoilKit提取各样品的总DNA

7、,使用NanoDropND^lOOO对提取的总DNA样品进行浓度和纯度检测。1.3.3PCR扩增及纯化参照文献［10］方法进行操作。1.3.5建库及Miseq测序参照文献［11］方法进行操作。1.3.6数据分析参照Pala-Ozkok等［12］的方法，进行序列筛选，数据降噪分析，获得样品中微生物群落结构信息。1.3.7生物信息分析(DNASTAR)进行序列分析，得出物种分类;分析多样本间的多样性;另外对单样本属水平上的分