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1、热带作物学报2014，35（5）：918-924ChineseJournalofTropicalCrops柑橘黄龙病可视化LAMP检测技术的建立及应用王贤达1，22232*，林雄杰，胡菡青，王宗华，范国成1福建农林大学植物保护学院，福建福州3500022福建省农业科学院果树研究所，福建福州3500133福建农林大学，福建福州350002摘要建立柑橘黄龙病（HLB）可视化环介导等温扩增（LAMP）检测方法，为HLB的快速检测提供有力的技术支持。根据LAMP技术原理，针对柑橘黄龙病菌16SrDNA靶序列的6个位点设计4条特异性引物，通过
2、对反应体系和反应条件的优化，并在反应前的体系中加入1∶10的钙黄绿素（calcein）和氯化锰（MnCl2）混合液作为荧光显色剂，建立可视化LAMP检测技术，同时对该技术的特异性、灵敏度和样品检测进行了测试。该检测方法具有很高的特异性，反应体系中除了HLB具有特异性的扩增，产生黄绿色荧光扩增产物，其他供试菌株均无特异扩增。对柑橘黄龙病菌总DNA的检测限为1.51×10-3ng/μL，而对含有目的基因的CG-pMD18-T质粒DNA的检测限为2.12×10-6ng/μL，与定量PCR灵敏度相当，而比常规PCR灵敏度高1000倍。利用可
3、视化LAMP技术和定量PCR对来自漳州、南平、福州等地的样品进行检测，结果2种技术的检出率均为76.7％，符合率达到100％。关键词柑橘黄龙病菌；钙黄绿素；环介导等温扩增（LAMP）；可视化中图分类号S436.66文献标识码AEstablishmentandApplicationofVisualLoop-mediatedAmplificationAssayonCitrusHuanglongbing1,22232*WANGXianda,LINXiongjie,HUHanqing,WANGZonghua,FANGuocheng1Plan
4、tProtectionCollege,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China2InstituteofFruitTreeSciences,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China3FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,ChinaAbstractAnovelmethodnamelyvisu
5、alloop-mediatedisothermalamplification(LAMP)wasestablished.ItwouldprovidestrongsupportforHuanglongbing(HLB)quickdetection.ThemethodisbasedonLAMPreaction.Theconservedregion,16SribosomalDNAinthegenomicDNAofCandidatusLiberibacterasiaticus(Las)wasamplifiedbyasetoffourspeci
6、ficprimersthatrecognizesixdistinctsequencesoftarget.CalceinandMnCl2(1∶10)reagentwereaddedintothemixbeforereactionandusedinLAMPproductjudgmentwithnakedeyes.AvisualLAMPmethodwasestablishedbytheoptimizedreactionsystemsandconditioninthisstudy,andthespecificityandsensitivit
7、ywastestinthefield.ThisvisualLAMPmethodwastremendouslyhighspecificity.OnlyLasinthereactionsystemwasspecificallyamplifiedwithgreenyellowfluorescenceproducts,theothersampleswasnotamplified,andwithoutanyproducts.ThelowestdetectionconcentrationsofLasDNAandLasplasmidDNAinth
8、emethodwere1.51×10-3ng/μLand2.12×10-6ng/μL,respectively.ThesensitivityofvisualLAMPwasequivalencywithreal-timePCRand10
