DB13T 2066-2014 牛胚胎性别鉴定技术规程

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1、ICS07.080B41DB13河北省地方标准DB13/T2066—2014牛胚胎性别鉴定技术规程2014-09-02发布2014-10-01实施河北省质量技术监督局发布DB13/T2066—2014前言本标准根据GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北省畜牧兽医局提出。本标准起草单位：石家庄天泉良种奶牛有限公司。本标准起主要草人：余文莉、苗玉涛、李树静、冯春涛、陈龙、毕江华、刘潇。IDB13/T2066—2014牛胚胎性别鉴定技术规程1范围本标准规定了牛早期胚胎性别鉴定的方法及操作程序。本标准适用于体内及体外生产的牛早期胚胎的性别鉴定。2规范性引用文件下

2、列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。NY/T1445-2007奶牛胚胎移植技术规程《中华人民共和国畜牧法》（中华人民共和国主席令第四十五号2005年12月29日）《乳品质量安全监督管理条例》(经2008年10月6日国务院第二十八次常务会议通过)《中华人民共和国专利法》（中华人民共和国主席令第八号2008年12月27日）专利：《牛Y染色体重复序列特异性引物及鉴定牛早期胚胎性别鉴定的PCR方法》，(专利号ZL200510011863.X)3术语和定义下列

3、术语和定义适用于本文件。3.1胚胎本标准中涉及的胚胎特指处于桑椹胚至扩张囊胚阶段的早期胚胎。3.2胚胎性别鉴定对早期胚胎显微取样，将样品DNA进行PCR扩增，通过检测雄性特异性基因片段的方式判断胚胎性别。3.3YCD试剂盒PCR扩增反应缓冲液，含有PCR反应所需的全部特异性引物、内标物、dNTP、Taq酶等。4体内胚胎的生产参照NY/T1445-2007的规定执行。5胚胎质量鉴定1DB13/T2066—20145.1胚胎获得获取处于紧缩桑椹胚（M）、早期囊胚（EB）、囊胚（B）、扩张囊胚（EXB）发育期的体内受精或体外受精胚胎。用形态学方法进行胚胎质量鉴定，将胚胎依次

4、分为1、2、3、4四级，其中1、2级胚胎可用于性别鉴定。5.2鉴定标准5.2.11级胚：发育正常，胚龄与发育阶段相吻合，卵裂球轮廓清楚，透明度适中，细胞密度大，卵裂均匀，无水疱样卵裂球，无变性的细胞。细胞变性率不超过15%。5.2.22级胚：发育基本符合预定胚龄，轮廓清楚，明暗适中或稍暗或稍浅，细胞密度较小或小型卵裂球过多，有小部分突出的细胞和水泡样细胞，细胞变性率为15%～50%。5.2.33级胚：轮廓不清楚，色泽过暗或过淡，细胞密度小，突出细胞占一多半，细胞变性率为50%～75%。5.2.44级胚：未受精卵和细胞变性率超过75%的胚胎。6操作程序6.1仪器与耗材6

5、.1.1操作应包括以下仪器：a)倒置显微镜；b)胎分割仪；c)PCR仪；d)电泳仪；e)胚胎冷冻仪；f)100L定量移液器；g)2L～20L可调微量移液器；h)3L定量移液器。6.1.2耗材应包括：a)取样吸头；b)通用吸头；c)分析管；d)0.25mL细管；e)细管塞；f)细菌滤器；g)6孔培养皿；h)ф60mm培养皿；i)ф35mm培养皿；j)50×TAE原液。6.2溶液2DB13/T2066—2014分为胚胎分割液、胚胎冷冻液、胚胎保存液。溶液配方见附录A。6.3操作步骤6.3.1样品分析管准备启动超净工作台紫外灯消毒20min后关闭，打开通风开关，用2

6、L～20L可调微量移液器向样品分析管中加8L超纯水，两个管不能同时打开，加样后立即盖住盖子。6.3.2做胶6.3.2.1取20mLTAE原液，定容至1000mL，混匀。6.3.2.2将电泳槽调至水平，胶盘用透明胶带封好，把两套梳子放在胶盘上，把胶盘放在电泳槽上。6.3.2.3准备好包胶用的保鲜膜、锡泊纸和放杂物的卫生纸铺垫。6.3.2.4称3g琼脂糖放入250mL的锥形瓶中。6.3.2.5量取120mLTAE缓冲液倒入锥形瓶中，摇动、混匀。6.3.2.6用一纸巾团松松地盖在锥形瓶上。6.3.2.7将锥形瓶放入微波炉，液体加热至沸腾3～5次至液体澄清，关闭微波炉静

7、置3min。6.3.2.8带好手套，取出锥形瓶加入5L溴化乙锭，迅速摇匀。6.3.2.9在冷水中冷却至70℃，之后把琼脂糖浇在已准备好的胶盘上，待凝固完全后取掉梳子，取下胶盘包好，待用。6.3.3取样6.3.3.1仪器安装及调试取出倒置显微镜，将操作手柄与切割仪连接。安装切割刀，使刀锋与显微镜台面平行，刀体与显微镜台面垂直。6.3.3.2平皿的准备洗刀平皿：在4个ф35mm培养皿中依次加入3mL超纯水、3mL无水乙醇、3mL超纯水、2mL胚胎分割液。洗胚平皿：在6孔培养皿中依次加入①孔1.5mL～2mL保存液（放置取样前胚胎）、②孔1.5mL～2m