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1、牡丹籽油抗炎作用的分子机理研究牡丹籽油(peonyseedoil,PSO)属于新食品资源,被专家评为优质食用油,是从牡丹籽中提炼的金黄色透明液态油。不饱和脂肪酸是PSO中最重要的活性成分,其中亚麻酸的含量所占比例为60%。研究表明PSO具有许多生理功能,最近研究显示PSO可能具有抗炎生物活性,但其具体抗炎功能分子机制尚无文献报道。本实验研究利用细胞和动物炎症模型:葡聚糖硫酸钠(sodiumdextransulfate,DSS)诱导ICR小鼠构建体内炎症模型和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞构成体外炎症
2、模型,共同对PSO抗炎功能进行评估及对抗炎作用的分子机理进行初步探究。实验结果为牡丹籽深加工及牡丹籽油保健食品的开发提供参考。实验观察发现:PSO干预组小鼠比DSS组精神状态明显好转,便稀、便血小鼠数量减少或无,结直肠病变程度减轻,疾病活动指数(diseaseactivityindex,DAI)评分降低趋势显著。使用苏木精-伊红染色法(hematoxylineosinstaining,H&E)检测小鼠结肠组织病变情况,显微镜下采集图片分析比较可知,DSS组小鼠病变情况如下:黏膜大面积糜烂,腺体隐窝结构完整性破坏较严重,有大量的炎性细胞如淋巴细胞及伴中
3、性粒细胞等浸润,杯状细胞数量显著减少,呈现出溃疡性结肠炎症状;而PSO干预组小鼠结肠出血较少,炎性细胞有少量浸润,结肠黏膜糜烂状况减轻,隐窝结构排列较为整齐、形态较为完整。通过测定小鼠血浆中组织损伤因子髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、丙二醛(malondialdehyde,MDA),发现DSS组中MPO和MDA和分别升高为对照组的3.5和3.2倍。同时也发现小鼠结肠组织损伤炎症介质一氧化氮(nitrite/nitrate,NO)含量升高了4.2倍;相比于DSS组,PSO组MPO、MDA和NO含量分别降低了20%、26%和22%
4、。从生化指标的角度,发现PSO能减少DSS诱导的小鼠损伤。荧光实时定量PCR技术(realtime-quantitativepolymerasechainreaction,RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹技术(westernblotting,WB)检测发现,与对照组相比,DSS组小鼠结肠组织中环氧化合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-lβ,IL-1β)和诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxide
5、synthase,iNOS)的mRNA表达水平显著升高,而PSO组相比于DSS组分别下降53.6%、41.0%、50.6%和54.2%。WB实验进一步证实了这些炎性细胞因子蛋白质表达水平有相似结果。检测结肠组织中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)信号通路关键靶基因的磷酸化表达情况。DSS组细胞外调节蛋白激酶1/2的磷酸化(phosphorylationofextracellularregulatedproteinkinases1/2、p-ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶的磷酸化(ph
6、osphorylationofc-JunN-terminalkinase,p-JNK)和p-p38蛋白质表达量为对照组的1.48±0.23、1.88±0.24、3.21±0.45倍。PSO组分别为对照组的1.23±0.15、1.45±0.25和1.48±0.34倍。结果显示PSO能抑制MAPK信号通路的活化,可能与其抑制炎症因子表达相关。体外实验中通过噻唑兰(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTS)法检测PSO对RAW264.7细胞毒性影响。结果显示PSO各组与对
7、照组OD值无明显差异。说明0～400μg/mLPSO溶液对RAW264.7细胞的生长、状态及活力无影响,证明对细胞无毒性,可用于后续实验研究。LPS组细胞COX-2、TNF-α、IL-1β和iNOS炎症因子mRNA表达量为对照组的5.66、7.59、6.78和2.62倍;而PSO25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL三组与LPS组相比,均呈剂量依赖性显著降低。蛋白表达量有相似结果。采用荧光素酶报告基因技术检测炎性细胞中炎症相关的核转录因子转录活性。相比于对照组,LPS模型组细胞AP-1/c-Jun(activatorprotein-1)与N
8、F-κB/p65(nucleartranscriptionfactor-κB)相对荧光素酶活性(RLU)分别
