基因工程技术ppt课件.ppt

《基因工程技术ppt课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、基因工程技术1Jackson,Symons,andBerg(1972)–generatedfirstrecombinantDNAmoleculesCohenandBoyer(1973)–producedfirstplasmidvectorcapableofbeingreplicatedwithinabacterialhostvectors–carriersofforeignDNATheNobelPrizeinChemistry19802定义：基因工程（geneengineering）重组DNA技术（recombinantDNAtechnique）：是指在各种

2、酶的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、细菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组DNA分子，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和表达，这种有目的的应用分子克隆技术,人为的改造基因,改变生物的遗传性状的系列过程,总称为基因工程3基因克隆(genecloning)：是指目的基因与载体DNA连接构成的DNA重组体在受体细胞内进行复制、扩增的技术。基因表达(geneexpression)：是指目的基因在受体细胞内表达，研究功能。4应用：克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成,生产多肽产品。转入

3、真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调控机制等5基因工程基本步骤：分、切目的基因+载体分子转导入到合适的受体细胞（转化）接构成重组DNA分子筛筛选含有重组分子的克隆鉴鉴定重组分子片段6基因工程流程示意图7构建重组分子（连接）原料：目的基因：研究对象载体：目的基因的运载工具工具酶：连接酶、限制性内切酶8目的基因片段来源：基因组DNAPCR方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它表达或克隆构建或从商品化的cDNA文库扩增）通过RT-PCR方法得到目的基因cDNA人工合成基因片段（价钱昂贵）9目的基因来源选择：取决于解决什么问题？基因功能研究cDNA

4、RT-PCR基因表达调控的研究基因组DNAPCR10PCR：引入合适的酶切位点，一个/两个。加保护碱基，1-3个。加上想要的标签，如Flag,Myc,His,HA。启始及终止密码子。高保真聚合酶：HF,Pfu,Probest等。11片断的回收与纯化12载体：载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。种类：按来源分：质粒载体(plasmidvector)、噬菌体载体(phagevector)、柯氏质粒载体(cosmidvector)、病毒载体(virusvector).按作用分：克隆载体(cloni

5、ngvector)、表达载体(expressionvector)、穿梭载体(shuttlevector)13克隆载体(cloningvector)用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建（PBR322）。表达载体(expressionvector)使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译（pCDNA3）。14穿梭载体(shuttIevector)能在两种不同的生物体内复制和往

6、来穿梭的载体.其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它即能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移。15质粒载体具有复制起始点，这是质粒自我增殖的必要条件。具有较小的分子量，较高的拷贝数，是一个松弛型的质粒。具有某种选择性标记以区别转化和非转化细胞。大多是一些抗菌素抗性基因，赋予受体细胞对某些抗生素的抗性，为转化子选择提供便利。（Ampr；Tetr）具有若干限制性内切酶单一识别位点，便于外源基因插入。是细菌染色体外能够自我复制的双链环状DNA分子。16克隆载体:

7、PBR322特点：分子量小，4.3kb，便于操作。有两个抗性基因，便于转化子筛选。有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，7种位于四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组和非重组分子。松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停止时，它仍能继续复制。171819TA克隆AA20TOPO-TA21原核His-tag:pQE系列(Qiagen),pET22(Novagen)GST-tag:pGEX系列(Pharmacia)表达载体：带有调控基因表

8、达所必需的转录与翻译元件，如启动子等，这些调控元件