植物基因工程在植物育种上的应用ppt课件.ppt

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1、植物基因工程在育种上的应用目录一、目的基因的分离和克隆二、植物基因工程载体三、外源基因导入植物受体的方法和转基因植物的检测目的基因的分离和克隆目的基因的概念分离目的基因的方法目的基因的扩增目的基因的概念基因：DNA分子上含特定遗传信息的可算序列总称，是遗传物质最小的功能单位。目的基因：对基因组中某个基因通过克隆扩增，获得该基因并进行研究和应用。简单说，就是在基因工程中，被分离、操作和表达的一种基因。分离目的基因的方法1、直接分离法2、化学合成法3、PCR法4、基因文库分离法直接分离法获取基因一、限制性内切酶酶切分离法二、酶促反转录法直接从特定mRNA克隆基因直接分离法获取基因一、限制性内切酶

2、酶切分离法适于从病毒、质粒等简单基因组中分离目的基因。优点是由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。缺点是目的基因内部也可能有该内切酶的切点，目的基因也被切成碎片。分为三种方法：1、对已定序的DNA分子，用已知的限制酶消化。2、对已定位的基因，据基因两侧的序列选择内切酶进行酶切。3、鸟枪法鸟枪法对未定序和无定位的基因，先通过酶切分析，再通过将某种生物体的全基因组或单一染色体通过机械切割如超声波处理、部分酶切和特定限制性内切酶全酶解（如果染色体DNA上目的基因的两侧含有已知的限制性内切酶识别位点，而且两者之间距离不超过载体装载量的上限）等方法构建一个简单的文库，或与载体连接后导入受体细胞形成

3、一套重组克隆，从中钓出目的基因。鸟枪法的缺点鸟枪法克隆目的基因有很大的局限性。①在一般情况下，利用探针原位杂交法筛选和检测重组质粒，可以较为简便地获得目的基因DNA片段，但若没有合适的探针可用，鸟枪法克隆目的基因的工作量很大，如同盲人打鸟。②鸟枪法实质上是克隆含有目的基因的DNA片段，如果目的基因是用于构建高效表达系统，则需要的是其编码序列而不是整个DNA片段，只有在其编码序列的上下游合适位点含有特征的限制性内切酶识别位点，后续操作才能顺序进行，遗憾的是这种情况并不多见。③90%以上的真核生物结构基因都具有内含子结构，这种真核基因不能在原核细菌受体细胞中表达，因此如果从真核生物中克隆目的基因

4、并在原核细菌中高效表达，使用鸟枪法显然是不合适的。直接分离法获取基因二、酶促反转录法直接从特定mRNA克隆基因用于合成分子质量较大、转录产物mRNA易分离的目的基因。又称cDNA法。cDNA是与mRNA互补的DNA（ComplementaryDNA），它并非生物体内的天然分子。将供体生物细胞的mRNA分离出来，利用逆转录酶在体外合成cDNA，并将之克隆在受体细胞内，通过筛选获得含有目的基因编码序列的重组克隆；如果基因序列清楚，则直接用RT-PCR克隆基因。这就是cDNA法克隆蛋白质编码基因的基本原理。cDNA法的优点①cDNA法能选择地克隆蛋白编码基因，而且由mRNA反转录合成的cDNA对特

5、定的基因而言只有一种可能性，这样大大缩小了后续筛选样本的范围，减轻了筛选工作量。②cDNA法克隆的目的基因相当“纯净”，它既不含有基因的5’端的调控区，同时又剔除了内含子结构，有利于在原核细胞中的表达。③cDNA通常比其相应的基因组拷贝要小数倍甚至数十倍，一般只有2-3Kb或更小，便于稳定地克隆在一些表达型质粒上。因此，利用cDNA法将真核生物蛋白编码基因克隆在原核生物中进行高效表达，是基因工程常用的战略思想。cDNA法的基本程序mRNA的分离纯化双链cDNA的体外合成双链cDNA的克隆cDNA重组克隆的筛选化学合成法1976年H.G.Khorana提出了如果目的基因的全序列是已知的，则可以

6、利用化学合成法直接合成基因的设想。随着核酸有机化学的发展，目前已能利用DNA合成仪自动合成不超过50个碱基任何特定序列的寡聚核苷酸单链。化学合成法的优点1、化学合成的DNA单链小片段可以直接作为核酸杂交的探针、分子克隆中的人工接头以及PCR扩增中的引物。2、由序列部分互补或全互补的一套寡聚核苷酸单链样本，通过彼此退火，可直接装配成双链DNA片段或基因。3、根据受体细胞蛋白质生物合成系统对密码子使用的偏爱性，在忠实于目的基因编码产物序列的前提下，更换密码子的碱基组成，从而大幅度提高目的基因尤其是真核生物基因在原核受体中的表达效率。目前常用的方法1、磷酸二酯法2、磷酸三酯法3、亚磷酸三酯法4、固

7、相合成法5、自动化合成法磷酸二酯法的合成原理①保护dNTP的5’端P或3’端-OH，以保证合成反应的定向进行。②带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。③用酸或碱的脱保护磷酸二酯法合成过程磷酸三酯法的合成原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。因此合成的二核苷酸连接处有三个酯键。固相磷酸三酯合成法固相磷酸三酯合成法是目前通