第七章酶分子工程-化学修饰

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1、第七章酶的分子工程之二：酶蛋白的化学修饰酶修饰的方向1．核酸水平2．蛋白质水平本章主要介绍第二个部分一、酶蛋白的化学修饰酶的化学修饰主要是利用修饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或经一定的活化步骤后与酶分子上的某种氨基酸残基产生化学反应，从而改造酶分子的结构与功能。二、酶的分子修饰的目的：1.研究酶的结构与功能2.增强酶天然构象的稳定性与耐热性3.维持酶结构功能的完整性与抗蛋白水解酶4.消除酶的抗原性及稳定酶的微环境SOD：对普通非活性部位赖氨酸中∈—氨基的修饰在保留原有的生物活性，稳定性增强

2、、在体内半衰期长，由6min-15min,延长到15hr以上。SOD的化学修饰可以增强SOD构象的稳定性、抗蛋白水解酶的能力及消除对人体的免疫原性。真正能够产生抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗炎、祛班美容等功效。具体说来，如：提高酶活力改进酶的稳定性允许酶在一个变化的环境中起作用改变最适pH值或最适温度改变酶的特异性；使它能催化不同的底物，使之转化为产物改变催化反应的类型提高催化过程的反应效率等等三、影响蛋白质化学修饰反应进程的因素（一）影响蛋白质功能基反应性的因素微区的极性氢键效应静电效应位阻效应蛋

3、白质功能基的超反应性微区的极性微区的极性是决定基团解离状态的关键因素之一。介质极性降低，pK升高：乙酸：水80%乙醇100%乙醇pK：4.766.8710.32从整体来看，局部极性的改变对色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反应性的影响最小；对氨基和组氨酸反应性的影响较大；对酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反应性影响最大。极性对整个反应速度的影响还与反应的类型有密切关系静电效应:不同蛋白质中的组氨酸残基的pK值是不同的。例如，碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基，其pk值是：碳酸酐酶：5.91；6.04；

4、7.00；7.23葡萄球菌核酸酶：5.37；5.71;5.74；6.50组氨酸残基在这两个蛋白质中的pK值范围是5.37～7.23，几乎相差2个pH单位。模型化合物的数据指出，这些变化可能是由于带电基团相互影响所致。位阻效应：处于蛋白质表面的功能基，：一般说来比较容易与修饰剂反应。但是，如果烷基在空间上紧靠功能基，会使修饰剂不能与功能基接触，这时就要出现位阻效应。对枯草杆菌蛋白酶：它的所有的10个酪氨酸残基均在蛋白质分子表面，而且其羟基几乎在所有情况下都没有形成氢键。但是，如果对它进行彻底硝化和

5、碘化后，10个酪氨酸中，只有8个被修饰。这种情况很可能是空间障碍引起的。蛋白质功能基的超反应性超反应性：蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应。多数蛋白质的功能基与简单氨基酸中的同样基团相比，反应性要差。但是，每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定的试剂显示出超反应性。酶的催化活性基团通常对修饰剂是有反应性的，但酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团，可能与酶的功能或构象没有明显联系。例如，木瓜蛋白酶中的19个酪氨酸残基中，只有一个能与二异丙基氟磷酸酯反应，修饰后酶活性并不改变。还有

6、几种因素也能改变蛋白质功能基的反应性，如电荷转移，共价键形成，金属螯合旋转自由度等。（二）修饰剂反应性的决定因素选择吸附静电相互作用位阻因素催化因素局部环境的极性选择吸附化学修饰前，修饰剂是根据各自的特点，选择性地吸附在低或高极性区的，有时可以根据对速度的饱和效应，检测出蛋白质-修饰剂复合物的形成。正象酶-底物复合物那样，蛋白质-修饰剂复合物形成后，修饰过程的速度加强了。这种速度加强，部分是由于选择性吸附的结果。静电相互作用带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位。静电相互作用可

7、使修饰剂向多功能部位中的一个残基定位，或向双功能基的一侧定位。此外，静电排斥力能抑制修饰作用位阻因素蛋白质表面的位阻因素，或者底物、辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。如果修饰剂的大小超过这个部位的大小，则不能发生修饰反应催化因素修饰部位附近的其它功能基，如果起一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。不同的修饰剂，其反应速度和反应部位有明显差异。例如、对硝基苯乙酸盐和苯乙酸盐对胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸的乙酰化属于同一机理，但苯乙酸盐的反应性差，这在较大程度上与酶的酸碱

8、催化有关。局部环境的极性许多有机反应的速度与溶剂的极性有关，而有些反应则与极性无关。溶剂效应是很复杂的四、设计酶的化学修饰（一）对酶性质的了解酶的活性中心酶的稳定条件最佳反应条件酶的侧链基团的性质等等（二）修饰剂的选择实际要根据修饰目的来选择：1）：如：对氨基的修饰可有几种情况：修饰所有氨基，而不修饰其它基团；仅修饰α-氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基以及修饰具有催化活性的氨基等。修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件来控制。1.选择修饰剂要考虑的问题2）：如果修饰目的是希望改变蛋白质