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时间:2020-07-30
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1、PCR技术及载体构建主讲:胡兴旺20150115主要内容PCR原理简介PCR反应体系及条件PCR引物设计克隆载体的选择和构建PCR原理简介主要内容PCR原理简介PCR反应体系及条件PCR引物设计克隆载体的选择和构建PCR反应体系10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物(终浓度)各100~250μmol/L引物(终浓度)各5~20μmol/L模板DNA0.05~1μgTaqDNA聚合酶5~10UMg2+(终浓度)1~3mmol/L补加双蒸水100μl酶自带,有些是2X扩增高GC含量的序列可以额外添加GC或选择相应Buffer可通过观察电泳结果,引物为最前小于100bp的带从质粒亚克隆5
2、0ng做模板,第一轮PCR产物稀释10倍作为第二轮模板根据需要选择对应的酶。高保真酶产物不能用于TA克隆Buffer自带。额外添加Mg浓度越高,酶活性增加,保真性降低PCR反应条件(program)94℃5min94℃30sec48-65℃30sec72℃30-nsec72℃10min4-18℃Hold预变性25-35Cycles后孵育Tm-5℃扩增不出来怎么办?!1首先检查模板,引物,试剂是否有问题。2尝试更换模板,退火温度,Mg2+,Gcbuffer,换酶3重新设计引物。拆段扩增。有杂带怎么办?!条带位置不对怎么办?!1提高退火温度。2使用Touchdown3重新设计引物。1更换模
3、板2重新设计引物。使用巢式PCR有拖尾?!主要内容PCR原理简介PCR反应体系及条件PCR引物设计克隆载体的选择和构建模板来源1、全新基因,从头开始克隆。根据所需检测的病原体或者待检特定基因,在ncbi或其他数据库网站查询有关序列。使用cDNA作为PCR模板2、已有全长质粒,从质粒亚克隆。使用已知序列为模板设计引物,用质粒作为PCR模板引物设计的基本原则①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。Tm值控制在55-60度。②引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
4、③引物内部不应出现互补序列。④两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3′端的互补重叠。⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续5个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。常用的引物设计软件PrimerPremier5.0(自动搜索)*vOligo6(引物评价)vVectorNTISuitvDNAsisvOmigavDNAstarvPrimer3(在线服务)*Tip:引物设计完成后可以到NCBI上做一下比对。选出相对特异性较好的候选设计。打开PrimerPremier5.0导入模板序列选择Primer设置搜索参数等待搜索结果逐条查看引物详
5、细参数Primer3在线设计引物主要内容PCR原理简介PCR反应体系及条件PCR引物设计克隆载体的选择和构建引物设计完成与载体克隆F:gcGAATTCggATGGGTCGACAGAAGGAGCT引物匹配区域补齐读码框添加碱基添加酶切位点酶切保护碱基载体的选择启动子抗性基因质粒骨架标签和多克隆位点最后需要注意的几个地方1读码框,千万不要移码。2注意标签表达的融合蛋白的前(N)端还是后(C)端。前:F引物对好读码框,R引物添加终止密码后:R引物要去除终止密码并补齐读码框3酶切位点的选择。4每次提质粒后都酶切验证。5养成读说明书的习惯。谢谢大家!
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