各种同工酶的染色方法.doc

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1、各种同工酶的染色方法一、淀粉酶⑴、制胶方法：分离胶（6%）：分离胶贮液：2.95mLTris-柠檬酸（pH8.9）：10.95mL2%Na2SO4：0.4mL1%过硫酸铵：0.4mLTEMED：20μL配制方法：分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis贮液）：30gAcr+0.8gBis加重蒸水50mL（可加热溶解）→定溶至1000mL（pH4.8～5.1，冰箱内可放置2～3个月）Tris-柠檬酸（pH8.9）：15.5gTris+1g柠檬酸（C6H8O7·H2O）加重蒸水溶解，调pH至8.9（用

2、1mol/LNaOH或1mol/LHCl调），最终定溶至1000mL，滤纸过滤后置冰箱中保存。2%Na2SO4：1gNa2SO4加重蒸水定溶至50mL，冰箱中可保存1个月。1%过硫酸铵：0.5g过硫酸铵加重蒸水定溶至50mL，冰箱中可保存1周。浓缩胶（3%）分离胶贮液：2.0mLTris-柠檬酸（pH6.8）：2.0mL2%Na2SO4：0.2mL蒸馏水：14.8mL1%过硫酸铵：0.6mLTEMED:30μL配制方法：浓缩胶贮液：同分离胶贮液。Tris-柠檬酸（pH6.8）：1.55gTris+

3、0.1g柠檬酸（C6H8O7·H2O）加重蒸水溶解，调pH至6.8，最终定溶至100mL，滤纸过滤后置冰箱中保存。⑵、染色方法：1.1%可溶性淀粉（一定要在沸水中煮沸到无色透明无沉淀为止），均匀地涂倒在胶板面上。静置1小时。2.用0.15mol/LHAc缓冲液（pH5.0）洗去胶板表面剩余的淀粉，然后加100mL0.15mol/LHAc缓冲液（pH5.0），在37℃温箱保温1.5小时。3.加显色碘液10mL，在兰色背景上出现白色透明、粉红、红或褐色条带，即为淀粉酶。配制方法：1%可溶性淀粉：0.1

4、g可溶性淀粉溶于10mLpH8.9的Tris-柠檬酸缓冲液中，在水浴中煮沸，搅拌到完全透明无沉淀为止：——本试剂需随配随用。0.15mol/LHAc缓冲液（pH5.0）：称取11.9gNaAc，加重蒸水溶解，用冰HAc调pH至5.0，最终加重蒸水至1000mL。显色碘液：称取KI15.8g，加到10g碘溶液中（先在95%乙醇中溶解），最终加重蒸水至1000mL，用时稀释20倍。⑶、保存液：固定液：冰醋酸:甲醇:水=40:100:320⑷、电极缓冲液贮液：采用低离子强度电极缓冲液，称取6.2gTri

5、s，加入2.0gGly，加重蒸水定容至1000mL，用时稀释5倍，pH值8.7。⑸、2%溴酚蓝溶液：称取1.0g溴酚蓝加蒸馏水至50mL。二、过氧化氢酶：⑴、制胶方法：分离胶（7%，20mL）分离胶贮液：4.5mL1mol/LTris-HCl（pH8.8）：7.5mL重蒸水：7.5mL1%过硫酸铵：0.5mLTEMED：35μL配制方法：分离胶贮液：同上1mol/LTris-HCl（pH8.8）缓冲液：称取121.14gTris放入1000mL烧杯中，加重蒸水800mL溶解，用浓HCl调至pH8.

6、8，倒入1000mL容量瓶，定容至1000mL，滤纸过滤，冰箱中可保存3个月。浓缩胶（4%，10mL）分离胶贮液：1.3mL1mol/LTris-HCl（pH6.8）：1.3mL重蒸水：6.4mL1%过硫酸铵：1.0mLTEMED：10.0μL配制方法：浓缩胶贮液：同分离胶贮液。1mol/LTris-HCl（pH6.8）：称取12.114gTris放入100mL烧杯中，加重蒸水溶解，用浓HCl调至pH6.8，倒入100mL容量瓶，定容至100mL，定性滤纸过滤，冰箱中可保存3个月。⑵、染色方法：1

7、、用蒸馏水将电泳胶板冲洗1～2次，然后用0.3%H2O2溶液100mL浸泡胶板1～5分钟，在浸泡过程中不断振荡染色盘使之浸泡均匀。2、浸泡结束，倒掉过氧化氢溶液，并用蒸馏水将胶板冲洗1～2次。再用4%可溶性淀粉溶液100mL（染色前一天配置更好）浸泡胶板1小时。3、浸泡结束，倒掉淀粉溶液，用蒸馏水把胶板冲洗1～2次。再用50mL2%铁氰化钾和50mL2%三氯化铁混合物进行负染色10分钟，待胶板在草绿色背景上出现浅黄色酶带时停止染色，倒掉染色液，水洗胶板1～2次。配制方法：0.3%H2O2：1mL3

8、0%H2O2，加重蒸水至100mL。4%可溶性淀粉溶液：4g可溶性淀粉溶于100mLpH8.8Tris-HCl缓冲液中，在水浴中煮沸至透明无色为止。2%铁氰化钾：铁氰化钾2g溶解至100mL。2%三氯化铁：三氯化铁2g（3.33gFeCl3·6H2O）溶解至100mL。⑶、保存液：可直接用重蒸水。⑷、电极缓冲液：称取141.2gGly，加30gTris，加重蒸水定容至1000mL配成原液，用时稀释25倍，pH值8.3。三、苹果酸脱氢酶⑴、制胶方法：分离胶（7%）分离胶贮液：6.8m