western blot04------制胶这件小事.doc

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1、说到WesternBlotting，估计所有技术员都会联想到蓝底上的黑色条带，或者是仪器扫描的白底黑条图片。经过了漫长的实验流程，得到的会是清晰的、符合实验理论的完美结果，或者更多的是其他让自己略感失望的结局。比起其他分子生物学实验，WesternBlotting实验似乎更加冗长、更加考验技术，从实验准备，到最后曝光结果，任何一个步骤的丝毫疏忽，结果可能就差之千里。在这里，BioTNT我先放下之后繁琐复杂的操作步骤，和大家聊聊WesternBlotting实验基础中的基础——制胶。不要小看制胶这件小事哦！Western实验是从电泳跑胶开始的（之前的样本处理算在实验

2、准备里哈），因此电泳跑胶的质量直接影响到最终的实验结果，其中，聚丙烯酰胺凝胶的质量起到了决定性的作用。 要是在制胶时出现了瑕疵，会有怎样的结果呢？好不容易配好的分离胶在凝固时居然只剩下了一半！没法用了，只能重制！那你一定是个新手，漏胶什么的最容易出现了。曝光结束，发现条带不在同一水平线上，原本应在同一kDa值的条带却上上下下如同波浪线一般，好吧，那这块儿胶在配制的时候一定不匀。悲剧，从头开始吧！还是在曝光结束，发现在垂直方向上有那么一小条出现了空白（或者说是黑色曝光细斑），不巧的，影响到了目的条带。嗯，那就是你在制胶的时候混了那么一点儿小气泡进去，蛋白们在跑胶时碰

3、到气泡都绕道啦！继续的，曝光结束，发现目的条带和非特异条带挤作一团，难舍难分，没法作为数据，这种情况比较复杂，可能原因是电泳时间不够，抗体质量不佳，样本中的蛋白过量，etc. 但是，你有没有想过，可能是你选错了胶的浓度？还有诸如胶不凝、曝光条带大小不均、拔泳梳时坏胶、上样电泳时样本溢出等等问题，可能都与你制胶的小细节有问题哦！ 怎么样，小瞧了制胶，吃大亏了吧！还是好好的、严肃的来看待制胶这个问题吧！ 说到这个制胶，很多的少年们还不知道制的是什么胶吧（啊喂，前面说了，是聚丙烯酰胺凝胶啦！）？，在分子生物学实验中，常用的电泳胶有两种：琼脂糖凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶。这两

4、个凝胶有什么区别呢？咳咳，本质区别啊！琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。其孔径相当大，现广泛应用于核酸的研究中。也就是说，琼脂糖凝胶，可以区分的是电荷量，以及大分子量的物质。着重介绍一下我们的聚丙烯酰胺凝胶，他是聚丙烯酰胺聚合交联向成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。在电泳前，通过向样品加入还原剂(打开蛋白质的二硫键)和过量SDS（阴离子去垢剂），使蛋白质变性解聚，并与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖掉蛋白质之间原有电荷的差异，使各种蛋白质的电荷／质量

5、比值都相同，因而在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。也就是说，聚丙烯酰胺凝胶，可以区分的是分子量相对较小的物质。 那么，聚丙烯酰胺凝胶里到底有些什么成分呢？首先要说明的是，电泳时的聚丙烯酰胺凝胶其实是由两块（或者以上）不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶组合而成的，他们分别称为浓缩胶及分离胶，浓缩胶是4%聚丙烯酰胺凝胶，主要作用是将样本在上样时的高度差缩小，使得所有的蛋白能够处在同一起跑线上，进而得到更美观、更科学的数据。在部分实验室，并不用浓缩胶，这一做法不值得提倡哦！分离胶是真正的分子筛，通过聚丙烯酰胺形成的立体孔道，对不同分子量大小的蛋白进行分离。在

6、一些实验室，分离胶选用的是梯度胶，即为使用不同浓度的胶依次叠加，所得到的胶分离效果更佳，不过，制胶的步骤多了，失败的可能性也大大增加哦！对于新手来说绝不推荐！ 分离胶和浓缩胶中的成分基本相同，都是由以下这些组成：超纯水、聚丙烯酰胺、Tris盐酸、SDS、AP、TEMED。分别来说说它们的作用吧！超纯水：…不说了聚丙烯酰胺：由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)按一定比例混合而成，分子筛作用，分离不同分子量大小的蛋白。顺便一提哦，丙烯酰胺是剧神经毒哦！操作时候可要特别当心啊！聚丙烯酰胺毒性相对较小，但是还是注意些吧！Tris盐酸：缓

7、冲液，保证胶的pH值正常。SDS：十二烷基硫酸钠，阴离子去垢剂，打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖各种蛋白分子间天然的电荷差。AP：过硫酸铵，催化剂，加速聚丙烯酰胺形成立体结构，即加速凝胶。TEMED：N，N，N’，N’四甲基乙二胺，催化剂，加速聚丙烯酰胺形成立体结构，即加速凝胶。 在了解了这么多基本知识之后，我们终于可以制胶了吧！嘿，不！慢着！先想想，我们要制多少浓度的胶呢？不同的聚丙烯酰胺浓度所产生的分子筛作用不同，对之后的实验也会产生影响。常见的聚丙烯酰胺凝胶浓度有：8%、10

8、%、12%